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目的:异体人脐带间充质干细胞(alloUMSCs)是细胞疗法中优选的细胞来源。然而，免疫排斥反应是临床应用alloUMSCs修复急性下肢缺血性损伤的主要障碍。其中，HLA-Ⅰ类抗原是间充质干细胞(MSCs)引起免疫排斥反应的主要因素，且在缺血环境刺激下，MSCs表面的HLA-Ⅰ类分子表达显著增加。本实验通过CRISPR/Cas9技术敲除β-2微球蛋白（B2M，HLA-Ⅰ类分子的轻链），探究是否能够抑制alloUMSCs移植所介导的免疫排斥反应，增强缺血性后肢修复，并在此基础上深入探究其来源的外泌体中miRNA分子在缺血性后肢修复过程中的具体作用机制。
方法:以8-12周龄、雄性C57BL/6J小鼠作为实验主要研究对象。利用CRISPR/Cas9技术构建具有低免疫排斥性的B2M-UMSCs，同时通过结扎小鼠下肢股动脉及其所有分支，构建单侧下肢缺血模型。之后经肌内注射UMSCs及其来源外泌体，通过激光多普勒血流仪、小鼠跑步机、抓力仪等仪器对小鼠缺血下肢的血流及功能恢复情况进行比较性分析。同时对B2M-UMSCs及其来源外泌体进行miR-seq测序，探究B2M-UMSCs及其来源的外泌体中miRNA分子在缺血性后肢修复过程中的具体作用机制。
结果:Western Blot与免疫染色等结果显示，CRISPR/Cas9技术编辑后显著降低了UMSCs中B2M分子的表达。同时，注射alloUMSCs组小鼠体内发生了显著免疫排斥反应，而注射B2M-UMSCs组小鼠未引起CD8+T细胞介导的剧烈杀伤反应及C3补体大量沉积。通过对B2M敲除前后UMSCs来源的外泌体进行microRNA(miR)测序，发现miR-24在B2M-UMSCs来源的外泌体中显著富集，且在B2M敲除前后未发生显著变化。通过生物信息学分析将促凋亡基因Bim鉴定为miR-24的靶标。之后利用功能缺失与获得实验改变外泌体中miR-24的表达含量，实验结果表明B2M-UMSCs的有益作用主要由外泌体/miR-24/Bim抗凋亡途径介导。进一步发现，B2M-UMSCs及其来源外泌体通过抑制成肌细胞凋亡，能够显著改善缺血下肢的血流恢复与运动机能。
结论:本研究表明，通过CRISPR/Cas9技术敲低B2M表达的alloUMSCs是一种方便且有用的细胞来源，可促进缺血性后肢的血流及功能修复，同时也不会诱导体内免疫排斥反应的发生。所以我们的探究结果对于骨骼肌修复具有重要的临床借鉴意义，且为未来在组织修复与再生治疗中，为无需HLA配型、安全有效的细胞来源提供了更好的思路。
方法:以8-12周龄、雄性C57BL/6J小鼠作为实验主要研究对象。利用CRISPR/Cas9技术构建具有低免疫排斥性的B2M-UMSCs，同时通过结扎小鼠下肢股动脉及其所有分支，构建单侧下肢缺血模型。之后经肌内注射UMSCs及其来源外泌体，通过激光多普勒血流仪、小鼠跑步机、抓力仪等仪器对小鼠缺血下肢的血流及功能恢复情况进行比较性分析。同时对B2M-UMSCs及其来源外泌体进行miR-seq测序，探究B2M-UMSCs及其来源的外泌体中miRNA分子在缺血性后肢修复过程中的具体作用机制。
结果:Western Blot与免疫染色等结果显示，CRISPR/Cas9技术编辑后显著降低了UMSCs中B2M分子的表达。同时，注射alloUMSCs组小鼠体内发生了显著免疫排斥反应，而注射B2M-UMSCs组小鼠未引起CD8+T细胞介导的剧烈杀伤反应及C3补体大量沉积。通过对B2M敲除前后UMSCs来源的外泌体进行microRNA(miR)测序，发现miR-24在B2M-UMSCs来源的外泌体中显著富集，且在B2M敲除前后未发生显著变化。通过生物信息学分析将促凋亡基因Bim鉴定为miR-24的靶标。之后利用功能缺失与获得实验改变外泌体中miR-24的表达含量，实验结果表明B2M-UMSCs的有益作用主要由外泌体/miR-24/Bim抗凋亡途径介导。进一步发现，B2M-UMSCs及其来源外泌体通过抑制成肌细胞凋亡，能够显著改善缺血下肢的血流恢复与运动机能。
结论:本研究表明，通过CRISPR/Cas9技术敲低B2M表达的alloUMSCs是一种方便且有用的细胞来源，可促进缺血性后肢的血流及功能修复，同时也不会诱导体内免疫排斥反应的发生。所以我们的探究结果对于骨骼肌修复具有重要的临床借鉴意义，且为未来在组织修复与再生治疗中，为无需HLA配型、安全有效的细胞来源提供了更好的思路。