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第一部分肺腺癌中miR-145低表达的分子机制研究[背景]目前,肺癌是发病率与病死率最高的恶性肿瘤。本课题组前期研究表明,microRNA-145(miR-145)可以靶向OCT4基因抑制肺腺癌细胞株中干细胞的增殖,miR-145还能对肺腺癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)进行调控。针对miR-145下游靶基因及其生物学功能的研究已广泛报道,但miR-145作为一种肿瘤抑制性miRNA,其在包括肺腺癌组织内广泛低表达的分子机制则研究甚少。我们通过生物信息学分析发现miR-145编码基因上游启动子区域有较多CpG位点。为进一步肺腺癌中miR-145低表达的分子机制,我们采用Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析技术,对肺腺癌组织中miR-145上游启动子区域的甲基化情况进行定量分析。[方法]用来自Cancer Browser (https://genome-cancer.ucsc.edu/)的甲基化芯片数据。该芯片包含miR-145上游的三个甲基化位点(cg11671363, cg22941668, cg08537847).我们比较了这3个CpG位点在肺腺癌和癌旁组织的甲基化比例,另外, 我们用专业的甲基化数据分析网站MethHC (http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw)对miR-145上游CpG位点的甲基化程度和相应的miR-145表达进行了相关性分析。用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza-C)对肺腺癌细胞株A549、H1975及SPC-A-1进行处理,比较miR-145的表达变化。收集手术切除的肺腺癌及癌旁组织标本共20对,用磁珠法基因组DNA提取试剂盒protocol提取组织DNA。经DNA定量和纯度测定予以质检后,应用甲基化DNA定量分析平台和半定量RT-PCR技术,对癌和癌旁组织miR-145启动子区域的甲基化水平进行定量分析。[结果]根据来自TCGA的芯片数据,在肺腺癌组织中,miR-145上游CpG位点甲基化率显著高于癌旁组织,且其甲基化率和miR-145表达显著相关。经5-aza-C处理后,A549、H1975及SPC-A-1细胞系中的miR-145表达均明显上调。甲基化定量数据显示在肺腺癌组织miR-145基因启动子区域的甲基化率均值明显高于癌旁组织(0.59比0.32,P<0.01)。并且在肺腺癌组织中,miR-145基因启动子区域的所有13个CpG位点均呈显著高甲基化。[结论] miR-145表达与其编码基因上游CpG位点甲基化率相关。肺腺癌组织内miR-145基因启动子区CpG位点高甲基化与该基因表达水平变化密切相关。第二部分miR-145低表达与肺腺癌预后的关系研究[背景]MicroRNA(miRNA)可以通过细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程在肿瘤的发生、发展中发挥作用。已有越来越多的miRNA被证实可作为肿瘤的预后指标。鉴于miR-145在肺腺癌的发生、发展中所发挥的至关重要的作用,我们猜想它可能是肺腺癌预后的独立危险因素。[方法]我们联合应用原位杂交和组织芯片技术检测92例肺腺癌和癌旁组织中miR-145的表达情况。根据染色结果进行评分,将miR-145在肺腺癌中的表达和患者其他临床病例特征进行相关性分析,并结合预后资料进行生存分析。[结果]miR-145的表达和肺癌组织分化程度、淋巴结转移、胸膜侵犯以及TNM分期直接相关,并且可以作为肺腺癌预后的独立危险因素。生存分析显示,miR-145低表达组的患者其总生存期(HR=2.128,P=0.004)和无进展生存期(HR=2.182,P=0.003)均较短。单因素和多因素分析随后进一步证实miR-145低表达是肺腺癌的独立危险因素(OS:HR=1.787,95% CI=1.021-3.128, p=0.042; DFS: HR=1.833,95%CI=1.048-3.206, p=0.034)。[结论] miR-145是肺腺癌预后的独立危险因素。