耐盐菌株特性及其在高盐有机废水生物处理中的应用

• 作 者: 信欣
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 含盐废水 耐盐微生物 耐盐机理 UASB 难降解有机污染物

高盐有机废水种类很多，如医药废水、石油开采废水、化工及印染废水等，这些废水中既含大量的盐分(Cl^-、Ca²⁺、Na⁺等离子)，又含高浓度有机污染物，是废水处理领域中的技术难题，常规的生物法很难有效地处理该类废水。为了解决含盐难降解有机废水中高盐含量对传统生物处理系统的抑制问题，本文以高浓度氯离子（Cl^-浓度大于10000mg／L）高浓度有机废水（COD浓度大于20000mg／L）——皂素废水为研究基质，分离、筛选出既耐高盐、又可以高效降解有机污染物的微生物。我们首先依据菌株的生理生化特性以及16SrDNA序列的测试，把菌株鉴定到种；然后研究了菌株在不同的环境因素条件下降解皂素废水COD的能力；紧接着，本文以耐盐菌株V430为例，探讨了菌株的耐盐机理，为改善微生物生长环境、提高其处理效率提供生物学理论依据：最后，研究了耐盐菌株作为诱导菌投加到废水厌氧生物处理系统中，同未投加组对比，考察两反应器的启动、运行特征以及盐度对反应器运行性能的影响，为确定耐盐菌经济、高效地处理高盐有机废水工艺参数提供实验依据。本文取得的主要研究成果如下：1．从皂素废水生化处理系统的污泥中分离筛选出两株既有较高降解废水COD的能力又能在高盐度环境中生长良好的菌株（编码代号分别为S616和V430）。两菌株均能在盐度为0-12.6％CaCl₂的培养基中生长，且在0-9.0％CaCl₂的培养基中生长良好。2．采用了经典表型鉴定和16S rDNA序列分析相结合的方法对菌株V430和S616进行了生理生化以及分子水平的鉴定。确定菌株S616为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus），菌株V430为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。将菌株S616和V430的16s rDNA序列提交国际Genbank（http:www.ncbi.nlm.nih.gov）进行了登记，前者的登记号为：DQ355388，后者的登记号为：DQ355389。登记号的获得，标志着在国际上首先发现这两个菌株，它们的16S rDNA序列，被国际权威基因库所承认，拥有独立的知识产权。并且申报了发明专利6项。查阅有关资料，尚无芽孢菌属和葡萄球属在高CaCl₂盐条件下处理难降解有机废水的研究的报道。两耐盐菌株的获得，为生物法处理含高盐有机废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值和理论意义。3．菌株V430和S616降解皂素废水COD的最佳条件是：（1）当废水COD浓度为8040.0mg／L，[Cl^-]=28000mg／L，反应时间、pH、温度和接种量（菌悬液）／废水量（V／V）分别是96h、7-8、30-35℃和1∶50时，菌株V430对皂素废水COD的去除率可达65.3％；（2）当废水COD浓度为7986.4mg／L，[Cl^-]=19040.0mg／L，反应时间、pH、温度和接种量／废水量分别是48h、7-8、30-35℃和1∶50时，菌株S616对废水COD的去除率为78.9％。4．以耐盐菌株V430为例，首次研究了其在高CaCl₂盐条件下的生理生化特征，并探讨了耐盐机理。（1）采用扫描电镜利透射电镜结合的方法，观察了不同盐度培养的菌株V430细胞的表面和内部结构的变化，结果表明：高盐度（9.0％CaCl₂）培养基培养的菌株V430细胞外会出现明显的分泌物；并且高盐度下培养的菌株V430的细胞质密度均比对照组（0.2％CaCl₂）变浓，说明，在高盐度环境下生长的细胞内某些与调渗有关的物质（比如氨基酸、蛋白质、K⁺和季铵化合物（QAC）可能增加，来调节外界的渗透压，从而保证细胞能在高盐环境条件下生长繁殖。（2）采用电导率法和电镜观察法两者结合的方法，以非耐盐的一般菌株大肠杆菌E．coli和金黄色葡萄球菌S．aureus作对照，研究了菌株在高盐条件下的壁、膜的完整性变化情况。结果表明：高盐（9.0％CaCl₂）环境对细胞的胁迫首先作用于其质膜，一般非耐盐菌株往往表现出膜透性明显增大，其细胞壁、膜的完整性受到明显影响。而对于耐盐菌株V430来讲，其细胞膜的通透性增加不大，壁、膜结合紧密且完整。说明耐盐菌具有抵抗外界高盐压力的能力，其细胞的质膜仍具有选择透过性的独特功能，细胞内仍能维持其正常的渗透压以及膜电位。（3）菌株V430细胞的蛋白质的含量随着外界培养基中CaCl₂的含量的增加而增加。这说明：高盐条件下，菌株在胞内会产生一些新的蛋白。这些蛋白可以参与高盐条件下水分的吸收、离子、糖类、氨基酸和细胞代谢物等物质的转运和运输，并且还具有保护细胞膜的正常生理功能；当菌株V430细胞受到9.0％CACl₂胁迫，当胁迫时间为30min时，其细胞内的可溶性蛋白量迅速增加，并随着胁迫时间的增加而继续增加，直至到达一个动态的平衡状态。这说明，耐盐菌株V430能对外界高浓度CaCl₂盐环境做出快速反应，引起某些生理调节功能的蛋白产生；但是同时某些蛋白又会不断的水解一些氨基酸来参与生理活动。即蛋白质的合成与分解始终处于动态平衡之中，以适应新的环境。（4）菌株在受到高盐胁迫时，会在胞内短时间内迅速积累大量的K⁺、氨基酸、QAC。而菌株V430的第一生理生化反应是在细胞内先积累一定量的K⁺，并且K⁺的积累伴随着氨基酸（主要为谷氨酸）和QAC含量的增加；适量的外源K⁺有利于菌株体内游离氨基酸和QAC的合成。（5）高盐度下，游离氨基酸（主要是谷氨酸）和QAC是细胞的主要有机调渗物质。1）菌株V430细胞内游离氨基酸含量随外界培养基中盐度的增加而增加，并且，游离氨基酸库的增加主要来自谷氨酸的增加，同时，含量增加较多的氨基酸还有天冬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氮酸，缬氨酸和亮氨酸。耐盐菌株V430在低盐环境（0.2％CaCl₂）中，总游离氨基酸含量较高，达到了50.76mg·g dry cell^-1，谷氨酸占很大比例，这和革兰氏阳性菌（G⁺）的特点相一致。为调节在高盐浓度条件下胞内外的渗透压，革兰氏阴性菌（G^-）细菌主要积累谷氨酸，而G⁺则主要积累脯氨酸作为调渗物质。但本实验中，革兰氏阳性菌V430在高浓度盐环境中，其细胞内积累的游离氨基酸是主要是谷氨酸，而脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸和亮氨酸也有不同程度的增加，这一点又和普通的G⁺细菌不同。我们见过谷氨酸、脯氨酸作为耐盐菌的调渗物质的报道，而异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸至今在Staphylococcus菌属中的尚未见具体报道。这说明，菌株V430在高盐环境中的渗透调节机制有其独特的地方。并且耐盐菌株V430对外界CaCl₂浓度的变化的反应相当灵敏，在很短的时间内120min就能在体内产生大量游离的氨基酸(168.4 mg·g dry cells^-1)，以维持其正常的生理代谢活动，这也充分证明了耐盐菌株在高浓度CaCl₂环境中的快速调节和适应的能力。2) V430细胞内QAC的相对含量(OD_365nm值)随培养基所含盐度的增加而增加，培养基中CaCl₂浓度为0.2％时（对照组），菌株细胞内的QAC相对含量的OD_365nm值为0.172，当培养基中CaCl₂浓度分别升高为1.8％，5.4％和9.0％时，其OD_365nm值分别比对照组增加了0.86、3.20、6.03倍。这说明QAC在菌株V430耐盐渗透生理调节中扮演了相当重要的角色，特别是当盐度由5.4％CaCl₂上升到9.0％CACl₂时，其作用更为明显。并且，细胞在9.0％CACl₂胁迫下，胞内QAC相对含量的OD_365mn值也表现出了随着胁迫时间的增加而迅速增加的趋势，当胁迫时间为120min时，其OD_365nm值迅速增加，当胁迫时间为150min时，其OD_365nm值比胁迫前升高了5.9倍，这说明了耐盐菌株V430在高盐胁迫下，能在短时间内迅速积累胞内的QAC来平衡外界的高盐浓度。（6）不同盐度培养基培养到稳定期时的菌株V430细胞胞内的可溶性糖的含量随着培养盐度的增加而有所增加，但是增加幅度不大，并且，高盐条件（9.0％CaCl₂）培养的细胞，其胞内可溶性糖的含量会出现先增加后减少的现象，这说明这些可溶性糖在菌株抵抗外界高盐高渗透压的过程中却起着重要的能源供应者的作用，即这些糖类的分解释放的能量可供给生物进行生物大分子蛋白质、核酸等的合成，是菌株在高盐条件下能进行正常生命和生理活动的能源保证。（7）细胞壁表面的胞外分泌物和细胞中的Ca²⁺在菌株V430突然受到高盐胁迫时，并不像K⁺、谷氨酸和季铵化合物那样，能在较短时间内在胞内迅速聚积。高盐度条件下培养的菌株V430，胞内能集聚大量的Ca²⁺以及表面分泌物的大量出现，是细胞对高盐环境长时间的适应结果。（8）高盐条件下，菌株V430可以采用直接从外界环境中吸收和通过自身合成这两种方式米积累渗透保护剂，即菌株在高盐度下，通过从外界培养基内直接吸收K⁺，而胞内谷氨酸和QAC则通过自身合成途径积累的。5．以皂素废水为进水基质，耐盐菌株作为诱导菌投加到皂素废水生物处理系统中，以未投加组作对比，考察两反应器的启动、运行特征以及盐度对反应器运行性能的影响，结果表明：（1）耐盐菌的投加加快了反应器的启动并提高反应器去除有机污染物的性能。在反应器启动的第一阶段，只接种厌氧污泥的A反应器（以下简称A反应器）第23天时对COD的去除率达到88.57％；而对于投加耐盐菌的B反应器（以下简称B反应器）来讲，反应器只需14天对COD的去除率就达到95.29％。（2）采用逐步提高容积负荷、增加盐度的方式，有利于污泥的驯化。本实验中，当容积负荷为1.99kgCOD／（m³·d）和盐度（Cl^-浓度计）为9000-10000mg／L时，经驯化后的A反应器对皂素废水的COD去除率达到90.5％；B反应器对皂素废水的COD去除率达到98.99％，对废水有机物污染物的去除能力高于A反应器。（3）耐盐菌株的投加能够大大改善普通活性污泥活性低、运行效果差的缺点，提高反应器抗容积负荷的能力。进水盐度恒定（[Cl^-]=10000-12000mg／L），当反应器的容积负荷由2.5kgcOD／（m³·d）增加到4.5kgCOD／（m³·d），A反应器对COD的去除率随进水COD负荷的变化而明显变化，即变化幅度比较大，对COD的去除率平均为83.43％。而B反应器对COD的去除率随进水COD容积负荷的变化却保持相对稳定，即变化幅度不大，其对COD的去除率平均为93.94％。A反应器对Cl^-的去除率平均为10.07％，而B反应器对Cl^-的去除率平均为15.44％。（4）当进水中氯离予浓度为9000-14000mg／L时，对A反应器中的微生物产生轻度抑制。经驯化后的A反应器的污泥能正常高效稳定的运行（对废水中COD的去除率平均为87％）；而此条件下，B反应器对COD的去除平均高达96.32％。（5）当进水氯离子浓度为17000-22000mg／L时，对A反应器中的厌氧污泥产生中度抑制，A反应器对COD的去除效率下降到70％以下，系统中污泥的活性受到中度抑制。而B反应器在同等条件下，其反应器的污泥活性并没有受到明显抑制，适当的盐度反而有利于反应器中的耐盐菌的生长繁殖，对COD的去除率平均高达92.95％。（6）当进水中氯离子浓度为28000mg／L时，对A反应器中的厌氧污泥微生物产生严重的抑制作用。A反应器对COD的去除率曾一度下降到30％以下。经系统长达24天的恢复，系统对COD的处理效果只恢复到55％左右，而B反应器中的污泥仍然能保持较好的代谢活力和降解性能，对废水COD的去除率平均高达为84.41％。本文主要创新点如下：1．首次分离、鉴定了两株既耐高CaCl₂盐，又高效降解有机污染物的耐盐菌（V430和S616），结合其生理生化特征和菌株的16S rDNA序列，将菌株鉴定到种。确定菌株V430为腐生葡萄球菌，菌株S616为坚强芽孢杆菌。并以皂素废水为基质，研究了两菌株在高CaCl₂盐条件下，降解废水COD的性能。2．首次较系统地测定了耐盐菌株V430在高CaCl₂盐条件下，细胞内可溶性糖、氨基酸含量、蛋白质含量、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量、QAC以及氨基酸组分的变化。确定了K⁺、QAC、谷氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸等是菌株的主要渗透调节物质。3．首次研究不同盐度培养下的耐CaCl₂盐菌株V430细胞的表征变化情况。