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目的:本研究利用生物信息学软件及外源性细胞实验验证PDE4D与相关m i RNAs靶向调控作用,并检测PDE4D相关miRNAs、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及PDE4各亚型在AD皮损中的表达,确定其在AD中可能的分子机制作用,为探究AD的靶向治疗研究提供一定的依据。方法:(1)生物学信息预测与PDE4D基因3’UTR作用的miRNAs,选择出评分较高的miRNAs。收集AD患者皮损及正常皮肤组织,Trizol法提取皮损及正常皮肤组织的总RNA,实时荧光定量PCR测定具靶向关系miRNAs、PDE4各亚型、TNF-α、IL-1β及IL-6的表达情况。(2)构建PDE4D基因3’UTR及miRNAs进行引物设计,构建载体,细胞转染后双荧光素酶活性检测,然后在Ha Ca T细胞中分别转染m i RNAs模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)后测定miRNAs、PDE4D及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平。结果:(1)筛选并收集30例AD患者皮损和25例正常对照组的皮肤组织,q PCR检测皮损中PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D的表达,分析发现PDE4各亚型均在AD组中表达偏高,其中PDE4C在四个亚型中表达含量最低。PDE4A、PDE4C在AD组的表达水平略高于正常对照组,差异无统计学意义(P>0.05);PDE4B、PDE4D在AD组的表达水平显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)通过生物学信息分析初步预测与PDE4D基因3’UTR作用的miRNAs,选取评分较高的miR-199b-5p作为后续研究对象。q PCR检测所有皮肤组织中miR-199b-5p、PDE4D、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。结果表明miR-199b-5p在AD组中表达降低(P<0.05),PDE4D、IL-1β、I L-6在AD组中表达显著增高(P<0.05),TNF-α在AD组中表达略微增高(P>0.05);AD皮损中miR-199b-5p表达量与PDE4D、IL-1β、IL-6表达量呈弱相关性(P<0.05);miR-199b-5p表达量与TNF-α表达量无明显相关性(P>0.05);PDE4D表达量与IL-1β、IL-6表达量呈正相关(P<0.05);与TNF-α的表达无相关(P>0.05)。(3)miR-199b-5p转染PDE4D基因3’UTR突变型和野生型载体后,双荧光素酶活性检测发现PDE4D-WT+miR-199b-5p组的相对荧光素酶活性明显降低,表明miR-199b-5p能靶向结合PDE4D基因3’UTR。(4)将miR-199b-5p模拟物、抑制物及阴性对照等5组样品共转染Ha Ca T细胞后测PDE4D、TNF-α、IL-1β及IL-6的水平,结果表明miR-199b-5p抑制了IL-1β、IL-6的表达,但未发现对PDE4D、TNF-α有调控作用。结论:(1)PDE4各亚型在AD中存在差异性表达,这为今后高效抑制剂的设计提供一定的理论指导。(2)miR-199b-5p、PDE4D、TNF-α、IL-1β、IL-6共同参与AD的表达调控,miR-199b-5p对AD的发病机制和病情进展的作用与炎症因子相关,而miR-199b-5p和炎症因子在AD中的作用机制可能与氧化应激和脂质代谢过程有关。(3)miR-199b-5p与PDE4D的细胞水平结果和皮损结果存在不一致,miR-199b-5p是否抑制PDE4D的表达尚未可知,其作用机制需进一步研究。