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【目的】 1、分离培养犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),体外扩增并向成骨细胞诱导分化,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。 2、制备犬同种异体脱钙骨基质(demineralized bone matrix, DBM),研究DBM作为骨组织工程支架材料的可能性。 3、研究应用富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)、带血管肌筋膜对组织工程骨血管化的影响。 【方法】 1、从犬骨髓分离MSCs,体外培养扩增,并用含地塞米松(10mol/L),β—甘油磷酸钠(10mmol/L)和维生素C(50mg/L)的成骨诱导培养基成骨诱导培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法测定细胞生长曲线。成骨诱导细胞行改良钙钴法碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色,并应用Von Kossa法、茜素红法进行钙结节染色。 2、杂种犬的股骨行脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白、冷冻干燥、灭菌制成DBM,与MSCs复合,分别在不同时间应用倒置显微镜、扫描电镜观察脱钙骨基质的结构及细胞在材料表面的生长情况。 3、将DBM/MSCs复合体植入12只犬背部,根据是否加入PRP和被带血管肌筋膜包裹分为4组。分别在术后4周、8周12周各处死4只犬,行大体标本、X线、组织学检查。 【结果】 1、用密度梯度法分离的MSCs,细胞纯度高,增殖能力活跃,诱导成骨分化的MSCs由梭形、三角形变为变为方形、多角形,其ALP及钙结节染色均为阳性。犬MSCs和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。 2、同种异体脱钙骨基质具有三维立体网孔结构,平均孔隙自径约为254.39±88.71μm,孔隙率约70%。与MSCs复合培养后,细胞黏附其上,上架率高,生长状态良好,增殖迅速,分泌大量细胞外基质。