论文部分内容阅读
在过去的数十年中,下呼吸道感染的发生率明显增加,成为危重患者及免疫功能抑制患者的重要死亡原因。革兰阴性细菌是下呼吸道细菌感染,尤其是医院获得性肺炎的重要病原菌。快速而准确地鉴定细菌菌种,为临床医师提供合理使用抗生素依据十分重要。然而,常规的形态学、生物化学鉴定细菌方法耗时且劳动量大,不能达到快速鉴定的作用。变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)技术对基因突变、小片段插入或缺失等DNA序列变异的检测具有快速、准确、灵敏、经济、自动化和高通量的特点。其原理是在部分变性的条件下,异源双链因错配区的存在,在色谱柱保留时间短于同源双链,而先被洗脱出来,据此用于分析混合PCR扩增子的多态现象。近年,国外学者运用PCR-DHPLC技术对耐氟喹诺酮淋病双球菌、耐喹诺酮金黄色葡萄球菌、耐喹诺酮肠道沙门氏菌、结核分枝杆菌进行分析；2002年,William Hurtle首次将该技术应用于细菌鉴定。结果表明只要选择的DHPLC分析条件如柱温、缓冲液梯度、流速和洗脱时间等足够合适,可据DHPLC洗脱峰的峰型和出峰时间快速检测菌株种类,是一种很有应用前景的快速检测方法。本研究首次将该技术运用于鉴定常见下呼吸道革兰阴性细菌。
目的：创建和优化PCR-DHPLC检测7种下呼吸道常见革兰阴性细菌16s rRNA的分析条件,并建立其洗脱峰图谱库。旨在建立一个基于DHPLC技术的高通量、准确灵敏、稳定性好的、简便快捷的鉴定下呼吸道感染致病性细菌的分子生物学方法。
方法：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取7种下呼吸道常见革兰阴性致病细菌基因组DNA;在目标细菌16S rRNA的保守区设计通用引物,并在正向引物前加上不同长度的GC,特异性扩增出目的基因片段；采用WAVEMaker软件初步预测柱温、缓冲液梯度、流速等DHPLC分析条件后运用DHPLC对PCR扩增产物进行分析。通过分析单种及混合菌株优化PCR和DHPLC分析条件并获得各种细菌的特异洗脱峰图谱。最后选取115株来源于下呼吸道标本的临床分离菌株验证该方法的有效性。
结果：设计的通用引物能可特异性扩增目的细菌16s rRNA。优化的PCR及DHPLC分析条件:Ex Taq DNA聚合酶有较好的PCR扩增效果和稳定性,去核糖核酸酶水可有效降低假阳性,32个循环可得到合适的PCR产量,50.9℃为木实验的最佳退火温度。在DHPLC分析中,在引物前端加入40bp-GC能更有效的鉴别细菌；对于混合菌株,66.5℃的柱温,缓冲液流速在0.5 ml/min时可得到最好的分离效果；可在一支样本中鉴别出2种、3种、5种及7种菌种,但这种方法对混合菌株的区分能力随着细菌种类的的增加而有所下降。115株临床分离的细菌的重复性实验中,可见各种细菌的洗脱峰及出峰时间均有特异性,重复性好。
结论：应用PCR-DHPLC技术检测细菌的16s rRNA,可对下呼吸道革兰阴性致病菌种类进行鉴定。DHPLC是一种准确、快速、高通量、重复性好的分子生物学技术,对下呼吸道致病细菌鉴定有一定的应用前景,可建立一种基于DHPLC特异性图谱的快速鉴定致病细菌的方法。