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叶绿体是植物细胞特有的细胞器,是植物进行光合作用的场所。对叶绿体发育的研究将有助于对重要粮食作物进行改良和优化。在本研究中,我们从一个水稻籼粳交F6代自然群体中发现了一个水稻白穗突变体,由于之前在水稻中已报道了两个白穗突变体,wp1(whitepanicle1)和wp2(whitepanicle2),这个新发现的水稻白穗突变体被命名为wp3(whitepanicle3)。遗传分析表明wp3突变体的自穗性状受单隐性核基因控制,而其条斑叶的性状是通过细胞质遗传的。对wp3突变体的细胞学观察发现,wp3突变体中叶绿体的发育明显受阻。在突变体穗子中,绝大多数的叶绿体不能正常发育;而在突变体的条斑叶,其绿色部分细胞中有许多能正常发育的叶绿体,但在其白色部分的细胞中基本上观察不到具有正常结构的叶绿体的存在。色素测定分析结果显示,wp3突变体白色区域内的胡萝卜素含量大大降低。
通过分子标记连锁分析,先将水稻白穗基因WP3定位在第一染色体上的两个微卫星分子标记RM101和RM63.9界定的染色体区间,并发现WP3与微卫星标记SSR17共分离。通过扩大定位群体和创建新型DNA分子标记,将WP3精确定位在一个BAC克隆P0552C05上大约43kb的DNA区间内。在对该区间基因组DNA的测序和分析过程中,发现在wp3突变体中一预测基因的起始密码子ATG上游179bp处有一个约4.9kb的逆转座子的插入。对不同水稻品种的PCR分析也证明该位点逆转座子的插入是白穗突变体wp3特有的。根据以上结果,将该基因确定为水稻白穗基因WP3的侯选基因。进而对突变体的功能互补实验也证实该基因就是控制水稻穗部叶绿体发育的WP3基因。
对WP3基因的Southern分析结果显示,该基因以单拷贝形式存在于水稻基因组中。RT-PCR分析发现WP3基因只在水稻幼穗组织中特异表达,在水稻的根、茎和叶中都不表达。同时发现,在白穗突变体wp3的幼穗中WP3基因的表达被阻断。另外,在数据库中进行氨基酸序列同源性比较未发现与WP3具有同源性的蛋白质,结构预测发现在WP3蛋白质的N端有明显的跨膜结构域。以上结果说明WP3可能是一新的未知功能的膜蛋白。利用WP3:GFP融合蛋白进行WP3蛋白质在水稻中的亚细胞定位研究,结果发现,WP3蛋白被定位于水稻细胞的线粒体中。这些结果表明,WP3基因编码了一个未知功能的线粒体膜蛋白,它的正常功能是水稻穗部叶绿体的正常发育所必需的。