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随着发病率和死亡率的上升，癌症成为导致死亡主要原因，是一个值得全球关注的重大公共卫生问题。乳腺癌（breast cancer, BC）已经是生活中对人们的生命健康产生巨大威胁的一种常见的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌（triple-nagetive breast cancer, TNBC）是乳腺癌亚型的一种，指的是雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）及人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）三者同时为阴性的一种乳腺癌亚型，与其他类型的乳腺癌相比，三阴性乳腺癌恶性级别往往更高，远处转移风险也较高，特别是脑转移和骨转移，预后往往较差，而且具有明显的遗传易感性。因此，对于三阴性乳腺癌的发生、发展和治疗等相关的研究也被越来越多的人重视。药物化疗是治疗三阴性乳腺癌采取的常用方法之一，但治疗过程中产生的耐药性使得药效降低或失效降低，从而影响了治疗的效果。随着医学研究的发展，挖掘影响乳腺癌细胞耐药相关基因及其机制研究，对于改善临床治疗效果具有重要的意义。本课题研究的细胞周期检测点激酶2（cell-cycle checkpoint kinase-2，CHEK2）基因，是继在BC易感基因BRCA1/2之后发现的另一个易感基因。本文主要通过三个部分：动物实验、体外细胞实验和生物信息学分析，探讨CHEK2基因在三阴性乳腺癌对顺铂及奥拉帕尼耐药性中起到的作用及其可能机制。实验结果发现：CHEK2缺失促进肿瘤的生长;CHEK2 缺失通过调控 BC 细胞 MDA-MB-231 和 HCC1937细胞的CHEK2-p53凋亡通路，抑制细胞凋亡和细胞周期受到阻滞，增强BC细胞MDA-MB-231和HCC1937细胞对顺铂及奥拉帕尼的耐药性。我们还利用生物信息学对 CHEK2 基因突变影响乳腺癌药物耐药性存在的潜在机制进行了分析，发现CHEK2基因的突变直接或间接影响了AKR1C1、CYP3A4、CXCR7等基因的表达，从而对细胞色素P450代谢等重要的、与乳腺癌耐药性相关的通路进行调控，来影响BC对长期使用一些药物后的疗效改变，这为我们提供一个新的研究方向，以后继续CHEK2与P450方面的研究。通过以上的研究，我们期望能够为乳腺癌的早期预防干预、诊断、治疗提供有力的支持。但目前对易感基因的研究只是局限于单基因的研究推测，对多基因相互作用的联合研究较少，这也将是我们未来的研究方向。
第一部分 CHEK2基因对荷瘤小鼠三阴性乳腺癌细胞生长和成瘤能力的影响
目的：本部分研究旨在探讨CHEK2基因对荷瘤小鼠BC细胞生长和成瘤能力的影响。
方法：利用CHEK2-shRNA转染BC细胞株，将MDA-MB-231细胞株皮下注射接种于BALB/c雌性小鼠腋下制造TNBC荷瘤小鼠模型，造模成功后给予奥拉帕尼（AZD2281）灌胃治疗，分为A组：野生型对照组（CHEK2 WT）；B组：野生型低剂量组；C组：野生型中剂量组；D：野生型高剂量组。E组：突变型对照组（CHEK2 Y390C）；F：突变型低剂量组；G组：突变型中剂量组；H：突变型高剂量组。造模8周后，观察小鼠一般情况、CHEK2突变对小鼠肿瘤体积变化（抑瘤率）、肿瘤的重量和肿瘤组织病理形态学变化的影响。
结果：与野生型组相比，CHEK2突变模型组的肿瘤组织体积变大和肿瘤重量增加；与CHEK2突变模型组相比，治疗组的肿瘤组织体积有所变小和肿瘤重量变轻；与CHEK2野生型对照组相比，治疗组的肿瘤组织体积有所变小和肿瘤重量变轻；突变和野生两组治疗组相比，两组肿瘤组织均有变小，但突变治疗组较野生治疗组的肿瘤组织体积大和肿瘤重量重。CHEK2基因的表达在一定程度上可能对肿瘤组织的病理形态产生一定的影响，主要起到改善的效果。
结论：CHEK2基因在对BC肿瘤的生长可能有着一定的抑制作用的影响，奥拉帕尼在CHEK2突变情况下出现耐药，对乳腺癌肿瘤的治疗作用减弱。
第二部分 CHEK2突变对三阴性乳腺癌细胞治疗药物耐药性的影响
目的：本部分研究旨在探讨CHEK2基因功能障碍对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞耐药的机制。
方法：我们分别建立了稳定的CHEK2野生型（WT CHEK2）和CHEK2 Y390C突变型（CHEK2 Y390C）表达的MDA-MB-231细胞系和HCC1937细胞系，利用MTT法、细胞凋亡的测定等方法，分别进行了对各组细胞的细胞活力、细胞凋亡情况检测；同时，通过Western-blot法和RT-PCR法，我们还对细胞中与凋亡相关的一些基因的表达和蛋白的表达进行了检测。
结果：我们发现，顺铂和奥拉帕尼的IC50值在 CHEK2 Y390C表达的MDA-MB-231和HCC1937细胞中显著高于CHEK2 WT表达细胞和对照细胞。顺铂和奥拉帕尼（AZD2281）处理48 h后，CHEK2 WT组细胞活力表达低于CHEK2 Y390C组与对照组。同时，我们发现，相对于CHEK2 Y390C表达的细胞与对照细胞，在CHEK2 WT表达细胞的细胞凋亡显著增加；此外，与 CHEK2 Y390C表达组和对照组相比，CHEK2 WT表达的细胞中p-CDC25A、突变型p53，p21，Bax、PUMA和Noxa表达水平均较高。
结论：我们的研究结果表明，CHEK2 突变通过CHEK2-p53凋亡通路诱导了三阴性乳腺癌细胞的细胞凋亡，从而提高了三阴性乳腺癌细胞对顺铂和奥拉帕尼的耐药性。
第三部分 生物信息学分析CHEK2基因影响乳腺癌耐药性潜在机制
CHEK2突变影响三阴性乳腺癌耐药性的分子机制尚不清楚。癌症基因组数据库，为生物医学工作者研究癌症发生发展以及其它临床问题提供了样本和基因组资源。利用统计学方法，我们可以从组学大数据中预测一些临床科学问题的相关分子机制，对于在以后的主要进行的研究方面可能有着一定的大数据分析的支持，能够挖掘其中一些作为研究的一个方向。为了研究CHEK2突变影响三阴性乳腺癌耐药性的分子机制，我们从TCGA数据库中下载了1100例乳腺癌肿瘤组织样本和112例癌旁组织样本，根据样本的病例学分类，我们将样本分为三阴性乳腺癌肿瘤组织和三阴性乳腺癌癌旁组织；根据样本 CHEK2 突变情况，我们将样本分为CHEK2突变乳腺癌肿瘤组织和CHEK2野生型乳腺癌肿瘤组织。对上述样本基因表达数据的差异分析，共得到33个基因在三阴性乳腺癌肿瘤组织中和CHEK2突变乳腺癌肿瘤组织中均表现出异常表达。我们进一步对这33个基因进行了基因功能分析。初步推测 CHEK2 基因的突变直接或间接影响了 AKR1C1、CYP3A4、CXCR7 等基因的表达，从而对细胞色素 P450 代谢等重要的、与乳腺癌耐药性相关的通路进行调控，来影响BC对一些长期使用的药物疗效改变。经过数据挖掘发现突变病人的PUMA表达明显低于其他乳腺癌病人的平均值，与体外细胞实验结果一致。说明在CHEK2 kinase domain处的不同位点突变对于关键基因的调控方式是一致的。
第一部分 CHEK2基因对荷瘤小鼠三阴性乳腺癌细胞生长和成瘤能力的影响
目的：本部分研究旨在探讨CHEK2基因对荷瘤小鼠BC细胞生长和成瘤能力的影响。
方法：利用CHEK2-shRNA转染BC细胞株，将MDA-MB-231细胞株皮下注射接种于BALB/c雌性小鼠腋下制造TNBC荷瘤小鼠模型，造模成功后给予奥拉帕尼（AZD2281）灌胃治疗，分为A组：野生型对照组（CHEK2 WT）；B组：野生型低剂量组；C组：野生型中剂量组；D：野生型高剂量组。E组：突变型对照组（CHEK2 Y390C）；F：突变型低剂量组；G组：突变型中剂量组；H：突变型高剂量组。造模8周后，观察小鼠一般情况、CHEK2突变对小鼠肿瘤体积变化（抑瘤率）、肿瘤的重量和肿瘤组织病理形态学变化的影响。
结果：与野生型组相比，CHEK2突变模型组的肿瘤组织体积变大和肿瘤重量增加；与CHEK2突变模型组相比，治疗组的肿瘤组织体积有所变小和肿瘤重量变轻；与CHEK2野生型对照组相比，治疗组的肿瘤组织体积有所变小和肿瘤重量变轻；突变和野生两组治疗组相比，两组肿瘤组织均有变小，但突变治疗组较野生治疗组的肿瘤组织体积大和肿瘤重量重。CHEK2基因的表达在一定程度上可能对肿瘤组织的病理形态产生一定的影响，主要起到改善的效果。
结论：CHEK2基因在对BC肿瘤的生长可能有着一定的抑制作用的影响，奥拉帕尼在CHEK2突变情况下出现耐药，对乳腺癌肿瘤的治疗作用减弱。
第二部分 CHEK2突变对三阴性乳腺癌细胞治疗药物耐药性的影响
目的：本部分研究旨在探讨CHEK2基因功能障碍对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞耐药的机制。
方法：我们分别建立了稳定的CHEK2野生型（WT CHEK2）和CHEK2 Y390C突变型（CHEK2 Y390C）表达的MDA-MB-231细胞系和HCC1937细胞系，利用MTT法、细胞凋亡的测定等方法，分别进行了对各组细胞的细胞活力、细胞凋亡情况检测；同时，通过Western-blot法和RT-PCR法，我们还对细胞中与凋亡相关的一些基因的表达和蛋白的表达进行了检测。
结果：我们发现，顺铂和奥拉帕尼的IC50值在 CHEK2 Y390C表达的MDA-MB-231和HCC1937细胞中显著高于CHEK2 WT表达细胞和对照细胞。顺铂和奥拉帕尼（AZD2281）处理48 h后，CHEK2 WT组细胞活力表达低于CHEK2 Y390C组与对照组。同时，我们发现，相对于CHEK2 Y390C表达的细胞与对照细胞，在CHEK2 WT表达细胞的细胞凋亡显著增加；此外，与 CHEK2 Y390C表达组和对照组相比，CHEK2 WT表达的细胞中p-CDC25A、突变型p53，p21，Bax、PUMA和Noxa表达水平均较高。
结论：我们的研究结果表明，CHEK2 突变通过CHEK2-p53凋亡通路诱导了三阴性乳腺癌细胞的细胞凋亡，从而提高了三阴性乳腺癌细胞对顺铂和奥拉帕尼的耐药性。
第三部分 生物信息学分析CHEK2基因影响乳腺癌耐药性潜在机制
CHEK2突变影响三阴性乳腺癌耐药性的分子机制尚不清楚。癌症基因组数据库，为生物医学工作者研究癌症发生发展以及其它临床问题提供了样本和基因组资源。利用统计学方法，我们可以从组学大数据中预测一些临床科学问题的相关分子机制，对于在以后的主要进行的研究方面可能有着一定的大数据分析的支持，能够挖掘其中一些作为研究的一个方向。为了研究CHEK2突变影响三阴性乳腺癌耐药性的分子机制，我们从TCGA数据库中下载了1100例乳腺癌肿瘤组织样本和112例癌旁组织样本，根据样本的病例学分类，我们将样本分为三阴性乳腺癌肿瘤组织和三阴性乳腺癌癌旁组织；根据样本 CHEK2 突变情况，我们将样本分为CHEK2突变乳腺癌肿瘤组织和CHEK2野生型乳腺癌肿瘤组织。对上述样本基因表达数据的差异分析，共得到33个基因在三阴性乳腺癌肿瘤组织中和CHEK2突变乳腺癌肿瘤组织中均表现出异常表达。我们进一步对这33个基因进行了基因功能分析。初步推测 CHEK2 基因的突变直接或间接影响了 AKR1C1、CYP3A4、CXCR7 等基因的表达，从而对细胞色素 P450 代谢等重要的、与乳腺癌耐药性相关的通路进行调控，来影响BC对一些长期使用的药物疗效改变。经过数据挖掘发现突变病人的PUMA表达明显低于其他乳腺癌病人的平均值，与体外细胞实验结果一致。说明在CHEK2 kinase domain处的不同位点突变对于关键基因的调控方式是一致的。