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苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis,Bt)MC28是从四川盆地沐川原始森林土壤中分离得到的,能在芽胞形成期产生大量球形伴胞晶体蛋白,对鳞翅目和双翅目昆虫具有明显的杀虫活性。前期研究采用PCR-RFLP (restricted fragment length polymorphisms, RFLP)鉴定方法从MC28中鉴定并克隆了5个杀虫晶体蛋白基因cry30Fa1、 cry53Ba1、cry54Aa1和cyt2Aa3),其中cry54Aa1编码蛋白对棉铃虫Helicoverpa armigera, Lepidoptera)、甜菜夜蛾(Laphygma exigua, Lepidoptera)和伊蚊(Aedes aegypti, Diptera)具有特异的杀虫活性；cry30Fa1编码蛋白对水稻褐飞虱(Nilaparvata lugens, Homoptera)具有特异的杀虫活性。为了研究MC28的基因组结构和进化特点,我们采用Illumina GA Ⅱ测序技术对MC28菌株进行全基因组测序。全基因组测序获得原始reads并过滤得到18,324,961个双末端reads,其对基因组的覆盖度达到451倍。采用SOAPdenovo组装软件将大约97.13%的reads组装成113个scaffolds。通过PCR、长片段PCR扩增以及构建Fosmid文库等策略对Scaffold内部和scaffold之间的gaps进行补洞,最终获得大小为6.68Mb的基因组完成图。利用Glimmer3.02对Bt MC28全基因组进行基因的预测,然后使用blast软件,将预测得到的蛋白序列与NR库进行比对,选择最好的比对结果作为相对应蛋白的注释,最终,MC28基因组总共注释得到6,555个蛋白。采用perl+SVG工具对Bt MC28和BtCT43及Bt YBT-020分别做共线性分析,结果表明：MC28与CT-43及YBT-020具有非常相似的基因组结构和共线性关系。采用MEGA和SplitsTree软件分别对Bt MC28和其它相关菌株构建系统发育树,两个结果均表明：Bt MC28菌株同其它Bt菌株在进化上距离较远,而是同Be Rock3-28、Bc Rock4-18、Bc Rock1-3和Be Rock3-29处在一个独立的分支上Bt MC28全基因组由8个环状复制子构成(1个染色体DNA和7个内生质粒),总长为6.68Mb。其中环状染色体DNA长度为5,414,461bp,编码5,279个预测的开放阅读框(ORFs),染色体DNA的G+C的百分含量为35.41%；7个环状内生质粒分别为pMC8、pMC54、pMC95、pMC183、pMC189、pMC319和pMC429,这些质粒共编码1,278个预测的开放阅读框(ORFs),其G+C的百分含量在32.11%和34.78%之间。Bt MC28基因组共编码74个tRNA和45个rRNA。通过Bt MC28全基因组测序,我们从中发现了3个编码杀虫晶体蛋白基因的质粒,而且从这些质粒上发现了6个新型的杀虫晶体蛋白基因分别为cry54Ab1、cry68Aa1、cry69Aa1、cry69Aa2、cry70Ba1和cyt1Da1,至此在Bt MC28菌株中共得到11个新型杀虫晶体蛋白基因。其中质粒pMC189上共携带了7个杀虫晶体蛋白基因分别为cry30Fa1、cry53Ab1、cry54Aa1、cry54Ab1、cry68Aa1、, cyt1Da1和cyt2Aa3；而质粒pMC95上共携带有3个杀虫晶体蛋白基因分别cry4Cc1、 cry69Aa1和cry70Ba1;质粒pMC183上仅含有一个与cry69Aa1同源性为96.2%的杀虫晶体蛋白基因cry69Aa2。cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1的长度分别为2,511bp、2,427bp和1,527bp。为了研究这三个基因编码蛋白的杀虫活性,我们通过PCR扩增将这三个基因分别插入到原核表达载体pET-28a中,再转入到原核表达感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,通过IPTG诱导表达,cry68Aa1, cry70Ba1和cyt1Da1基因分别产生约95kDa、90kDa和60kDa的表达产物,这与其预测表达蛋白的大小一致。生物活性测定结果表明：Cry68Aa1和Cry70Ba1均只对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有杀虫活性,其LC50分别为20.16μg/ml(95%的置信区间为16.34-35.72μg/ml)和30.22μg/ml(95%的置信区间为27.15-36.53μg/ml)，而两者对鳞翅目的棉铃虫和双翅目的蚊虫无杀虫活性；Cyt1Da1对所测的昆虫均无杀虫活性。cry69Aa1基因全长为3,651bp,编码1,216个氨基酸,其预测编码蛋白大小约为137.1kDa,与已知的Cry4Ba蛋白的同源性最高,但仅为39%。比较结果表明：Cry69Aa1和已知大分子量的Cry蛋白均含有8个保守区域(见图5-1),因此,Cry69Aa1蛋白属于大分子量Cry蛋白中的一类新型Cry蛋白。为了研究cry69Aa1基因编码蛋白的杀虫活性,我们将扩增得到cry69Aa1全长基因插入到穿梭载体pSTK中,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中。重组菌株的扫描电镜(SEM)观察结果表明：cry69Aa1在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体。生测结果表明：重组菌株的芽胞晶体混合物对双翅目的致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫具有明显杀虫活性,其LC5o为23.7μg/ml,95%的置信区间为20.5-26.4μg/ml。cry54Ab1操纵子是由两个相同编码方向的ORFs组成的,第一个ORF是与ory54A类似的cry基因,长度为2,232bp,其编码743个氨基酸,预测编码蛋白分子量84.5kDa,根据编码蛋白的同源性,这个cry基因被命名为cry54Ab1;第二个ORF位于cry54Ab1的下游,两者之间被一个长67bp的非编码区所间隔,这个ORF在本研究中暂命名为orf2基因,该基因长1,524bp,编码503个氨基酸,其预测蛋白分子量为58.2kDa。为了研究cry54Ab1操纵子的杀虫活性,我们将cry54Ab1基因、orf2基因以及完整的cry54Ab1操纵子通过PCR扩增后分别插入到穿梭载体pSTK上,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中表达。重组菌株的扫描电镜观察表明：当完整的cryS4Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体；当cry54Ab1基因或orf2基因单独在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,均不能形成伴胞晶体。SDS-PAGE电泳分析结果表明：完整的cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,两个ORFs均能够大量表达,然而当cry54Ab1基因和orf2基因单独表达时,两个基因的表达量非常低,尤其是orf2基因几乎不表达。另外生测结果表明：完整的cry54Ab1操纵子和cty54Ab1基因的表达产物均对双翅目的致倦库蚊有杀虫活性,但是完整的cry54Ab1操纵子表达产物的杀虫活性是cry54Ab1基因单独表达时的杀虫活性的10倍之多。由以上结果可知,orf2基因的表达不仅能够使Cry54Ab1蛋白形成球形伴胞晶体,而且能够提高Cry54Ab1蛋白的杀虫活性。