论文部分内容阅读
巴斯德毕赤酵母属甲基营养型酵母,作为第二代酵母表达系统的代表,经过近几年来迅速的发展,已经成为一个较完善的真核表达系统。它具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点,不仅用于工业生产而且用于基础研究领域。毕赤酵母分泌的内源性蛋白的量很少,利用其分泌表达到胞外的重组蛋白的纯度相对较高,易于纯化。分泌蛋白的N端是信号肽,它对外泌蛋白的分泌起主导作用。信号肽没有严格的专一性,因而可利用在表达载体的启动子后加入一个编码信号肽的序列,分泌外源蛋白。酿酒酵母的α交配因子(αmating factorαMF)信号肽在毕赤酵母引导外源蛋白分泌表达中广泛使用。αMF信号肽是prepro结构,引导外源蛋白进入分泌途径,pre肽在内质网被切除,由pro肽引导外源蛋白进入高尔基体,在高尔基体的Trans膜囊,Kex2p识别pro肽C端的KR双碱性残基位点并沿序列的羧基端切割,释放的外源蛋白经膜泡运输分泌到胞外。不同分泌蛋白的pro肽长度变化由几个到几百个氨基酸不等,在分泌过程的不同阶段发挥重要作用,如帮助蛋白易位进入内质网,作为分子伴侣协助蛋白正确折叠,提供分选信号等,将pro肽缺失会导致这些蛋白分别被阻滞于分泌途径的某一环节而不能实现分泌表达。鉴于pro肽在实现蛋白分泌表达中的重要作用,以大分子蛋白HSA,MBP分别作为pro肽考察其对外源蛋白分泌表达的影响,以IFNα2b为报告蛋白。构建的基因表达盒包括αMF信号肽19个氨基酸的pre序列, HSA, MBP分别作为pro肽,Kex2内切酶识别的双碱性残基位点和报告蛋白(IFNα2b),基因表达由可诱导的醇氧化酶AOX1基因启动子元件来控制。结果表明,HSA ,MBP均可作为有效的pro肽引导IFNα2b的分泌表达。HSA引导蛋白分泌时存在切割不完全的现象,部分蛋白以融合形式释放出来,对酶切位点进行优化后切割效率明显提高,以融合形式分泌的蛋白量减少。MBP单独可以在毕赤酵母中实现高效分泌表达,将其作为pro肽可有效的引导外源蛋白实现分泌表达,融合蛋白途经Golgi Trans膜囊时,Kex2内切酶识别MBP与IFNα2b之间的KR双碱性残基位点并发生高效切割,使IFNα2b与MBP分离,分泌到胞外。IFNα2b经N端氨基酸测序正确。Western blotting研究发现MBP滞留于分泌途径中,其具体机制尚不清楚。SDS-PAGE和ELISA定量分析比较结果表明,MBP作为pro肽引导IFNα2b分泌表达在表达量和酶切效率方面均与αMF信号肽有近乎相同的效果,可据此开发新型酵母分泌表达载体,为一些在酵母中低表达或不能分泌表达的蛋白实现高表达提供了新的思路。