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卵母细胞发育和胚胎生产是动物繁殖领域重要的技术环节。卵母细胞质量决定胚胎命运,并且与后代的健康密切相关。改善卵母细胞和胚胎质量对提高家畜繁殖效率具有重要的理论和实践意义。卵母细胞中大量活性氧积累是影响卵母细胞及胚胎发育的重要原因。罗汉果甜甙V(MV)作为罗汉果的主要药效成分之一,具有丰富的生物学特性,其抗氧化效果显著。为了探究罗汉果甜甙对家畜卵母细胞及胚胎发育的作用,本研究评估了MV对猪卵母细胞体外成熟的影响,初步讨论MV提高卵母细胞体外成熟的分子机制。通过单细胞RNA-seq技术从宏观角度解析MV提高卵母细胞体外成熟的转录本表达调控。此外,本文对MV延缓卵子老化的分子机制进行了初步探究,评估了MV对猪体细胞核移植胚胎以及孤雌激活胚胎发育的影响。结果如下:1.MV对猪卵母细胞体外成熟的影响为了优化MV浓度,将不同浓度的MV(1,5,10,20和40μM)添加至成熟液中,不添加MV组作为对照。卵丘卵母细胞经过40-44h成熟后,浓度为5,10,20和40μM的MV显著提高卵母细胞的第一极体排出率,由于20和40μM之间没有显著差异,因此选择20μM MV进行后续的试验。MV添加后,卵母细胞的孤雌激活胚胎分裂率和囊胚率显著升高,但是对体细胞核移植胚胎的发育没有显著影响。此外,MV显著促进卵母细胞皮质颗粒形成,提高线粒体相关基因PGC-1α和TFAM的转录水平,提高线粒体含量,增强线粒体活性和功能。MV还促进卵母细胞抗氧化基因SOD,CAT和PRDX2的转录水平,降低胞质ROS含量。通过添加SIRT1的特异性抑制剂EX-527发现,MV通过激活SIRT1,调节活性氧和线粒体,促进卵母细胞体外成熟。荧光素酶报告系统的结果表明MV可以提高SIRT1启动子活性。2.利用单细胞RNA-seq技术分析MV提高猪卵母细胞成熟的转录组变化成熟液中添加(处理组)或不添加MV(对照组),卵母细胞成熟40-44 h后,收集排有第一极体的卵母细胞,每组三个重复。提取卵母细胞的RNA,利用Illumina Hiseq测序平台进行c DNA文库构建。将获得的数据进行质量控制,搜库,差异表达基因分析,基因本体论富集分析,KEGG分析,结果验证等。总共检测到10631个共表达基因,差异表达基因440个,其中上调差异表达基因216个,下调差异表达基因224个。基因本体论分析结果显示应激应答差异表达基因上调30个,下调31个;DNA损伤修复基因上调9个,下调5个。此外,KEGG分析显示MV与卵母细胞的WNT信号,丙酮酸盐代谢以及脂肪酸合成密切相关。基于KEGG分析的结果进行荧光染色和TG酶反应试验,结果表明MV可以提高体外成熟卵母细胞的脂滴合成和甘油三酯的含量。实时荧光定量PCR验证结果(SOD,PRDX2以及TFAM)与单细胞RNA-seq的结果一致,表明转录组测序的结果可靠。3.MV对卵子老化的影响及分子机制体外成熟44 h后的卵母细胞作为新鲜组,添加MV(25,50和100μM)或不添加MV(老化组)的PZM-3培养液继续培养24 h。施加一个微弱的电刺激(0.6 k V/cm,2 DC,10μs),培养8 h后检查激活率(分裂和碎片)。相对于新鲜组来说,老化组的激活率显著上升,加入50和100μM的MV显著降低老化卵子激活率,后续试验选择50μM MV。当卵子老化24 h后,制作孤雌激活胚胎,结果显示老化卵子的囊胚率从31.1%下降到2.4%,而添加MV的老化卵子的囊胚率上升到14.3%。除此之外,MV还维持老化卵子纺锤体和染色体形态,减少凋亡形成,促进线粒体活性和功能,提高SIRT1的转录水平并降低ROS水平。当EX-527抑制SIRT1表达时,MV对老化卵子的抗氧化作用,纺锤体和染色体的改善作用都消失了,表明MV通过激活SIRT1,降低ROS水平,延缓卵子老化。4.MV对猪早期胚胎发育的影响构建孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎,添加20μM的MV到胚胎培养液PZM-3中,观察MV对胚胎分裂,囊胚形成,囊胚细胞数以及细胞活性的影响。对于孤雌激活胚胎来说,MV对分裂率,囊胚率,囊胚细胞数和细胞活性方面没有显著的影响,但MV将囊胚率从36.3%提高至43.8%,并且将囊胚细胞数从43.8提高到50.0,且MV将囊胚细胞Ed U阳性率从27.8%提高至33.1%。MV不影响SCNT胚胎的分裂,但是将囊胚率从9.8%提高至15.0%。在当前的体系中,MV对早期胚胎发育没有显著效果。综上所述,本研究利用猪卵母细胞和胚胎模型说明MV提高猪卵母细胞体外成熟,延缓卵子老化并阐明相关的分子机制,然而对早期胚胎发育没有显著影响。本研究结果为MV促进猪卵母细胞和胚胎发育的深入研究奠定基础。本文将有望为提高哺乳动物繁殖的相关研究提供新的思路。