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肺癌是目前发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤,其中以非小细胞肺癌为多见,约占肺癌所有病例的80%-85%。近二十年,肺癌的发病率每年以11%左右的速度递增,以此预计,我国肺癌的患者将在2025年达到世界“第一”。由于肺癌具有很强的侵袭、转移能力,所以是恶性度较高的肿瘤之一,且具有多种多样的生物学特性,致使早期诊断困难,大多数就诊时已是晚期,因此预后极差。在临床上,早期的手术治疗和晚期的化疗始终是肺癌最主要的治疗手段。顺铂(DDP)是多种恶性肿瘤的临床常用铂类化疗药物,能破坏DNA的结构和功能,产生抗肿瘤效应。但由于不同个体对该药物的敏感性不同,尤其是其对正常细胞的毒性作用,包括抑制骨髓的造血系统,肾脏毒性、神经毒性、耳毒性、肝毒性以及多药耐药性(MDR)等特点,限制了该类药物的应用。如果能在化疗的同时配合中医、中药,进行全身性的调理,则可以降低化疗对机体的毒副作用,提高肿瘤患者的生活质量。目前临床常采用联合用药的方式,这样即可降低化疗药物的给药剂量,又能减轻化疗药物的各种毒副作用,延缓MDR的产生,并可增强抗肿瘤疗效。近年研究证实,许多中药具有通过整体调节功能,增强免疫系统的作用,以促使肿瘤细胞死亡或诱导凋亡,从而抑制肿瘤的生长、转移等过程。甘肃道地药材黄芪是传统的扶正固本中药,归肺经,是补气药之一。黄芪多糖(APS)是其最重要的天然有效活性成分,是含量最多、免疫活性最强的一类物质,具有调节免疫、补益肺气、抗炎、增强巨噬细胞活性、抗肿瘤等多方面作用。因此,本研究根据中医扶正治疗的原则,初步探讨APS提高免疫功能、抗肿瘤、抗转移的分子机制及对顺铂的增效减毒机制。本课题分体外(细胞)、体内(动物)实验两部分进行研究。(1)体外实验通过噻唑蓝比色法(MTT)观察了不同浓度的APS对小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)生长的影响;激光共聚焦显微镜(LSCM)下检测不同浓度的APS对LLC细胞骨架、线粒体膜电位(MMP)及细胞内Ca2+浓度的动态变化。(2)动物实验部分主要通过LLC荷瘤小鼠模型,以低、中、高剂量APS及与减半剂量的DDP联合使用后对其进行干预,在计算抑瘤率的基础上,计算荷瘤小鼠的瘤质量、体质量、有效体质量等变化,并运用酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)、免疫组织化学(SP)、蛋白免疫印迹(WB)等方法研究其对瘤组织细胞生长、细胞因子及DDP所致免疫功能低下的影响;核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的信号通路相关分子表达的影响;肿瘤组织Caspase-9、Bcl-2、Bax、Fas L等凋亡相关基因和蛋白表达的影响;血清Ⅳ型胶原蛋白(Col4)和透明质酸(HA)含量等表达的影响。1.MTT显示:终浓度为50μg/ml~400μg/ml的APS各时间点均可不同程度的抑制小鼠LLC的增殖(P<0.05),以APS 200μg/ml作用最显著。2.LSCM显示:(1)APS各剂量组中LLC的微管、微丝排列早期出现分布变化,晚期数量减少,断裂、塌陷,荧光着色变浅(P<0.05)。(2)APS各剂量组在24、48、72h的时间点上,均可以明显降低小鼠LLC的MMP、升高细胞内Ca2+浓度(P<0.05),两者均在24 h内变化最明显,即早期作用显著。这可能是其促进肿瘤细胞发生凋亡的机制之一。3.中、高剂量APS及联合用药各组对Lewis肺癌小鼠均有显著的抑瘤作用(P<0.05),并可明显改善Lewis肺癌小鼠的体质量、有效体质量、瘤质量(P<0.05),以联合用药组作用更为显著。q值在0.85~1.15之间,提示APS与减半剂量的DDP联合使用,疗效具有相加效应。4.APS及联合用药各组可提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平(P<0.05);提高实验小鼠的胸腺指数和脾脏指数,说明APS能增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用。5.Q-PCR和WB显示:(1)APS中、高剂量组肺癌移植瘤组织NF-κBp65、P53的表达明显降低(P<0.05或P<0.01);但对p38MAPK基因和蛋白的表达影响不明显。联合用药低、中剂量组降低NF-κBp65、P53及P38表达的作用弱于DDP组(P<0.05或P<0.01),但高剂量组作用与DDP组接近(P>0.05)。(2)APS高剂量组及联合用药各组中,肺癌移植瘤组织Bcl-2、Fas L明显下降,而促凋亡蛋白Bax的表达明显升高(P<0.05);联合用药低、中剂量组,对Bcl-2/Bax、Fas L的影响不及DDP组(P<0.05),而联合用药高剂量组与DDP组间无统计学差异(P>0.05)。提示APS可能通过下调肿瘤组织中NF-κB、P53基因和蛋白的表达,下调Bcl-2、Fas L等抗凋亡基因的表达,上调Bax等促凋亡基因的表达,使Bcl-2/Bax比例降低,诱导肿瘤细胞凋亡,这可能是APS发挥抑瘤、抗转移作用的分子机制之一。6.SP提示:APS中、高剂量组肺癌移植瘤组织Caspases-9的表达明显增强(P<0.05或P<0.01);联合用药低、中剂量组的作用弱于DDP组(P<0.05或P<0.01),而高剂量组作用接近DDP组(P>0.05)。提示APS可能通过提高移植瘤组织中Caspases-9的表达,诱导肿瘤细胞的凋亡。7.APS各剂量组及联合用药组均可降低小鼠血清中Col4和HA含量,联合用药组作用更明显(P<0.05或P<0.01)。提示APS可能通过阻止肺癌移植瘤细胞与基质的黏附、减少基底膜降解,从而抑制小鼠肺癌移植瘤的侵袭和转移。8.上述作用在APS与减半剂量的DDP联合使用时,可增强DDP化疗效果,从而降低DDP毒性,对DDP具有增效减毒作用。