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水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一；由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是其生产上的主要限制因子。由于符合经典的“基因对基因”学说，稻瘟病病害体系已成为植物病理学研究的模式体系之一。稻瘟病抗性基因是该体系中的一个关键因子，分离、克隆抗性基因不仅能为稻瘟病抗性育种提供物质基础，而且也将有助于揭示寄主与病原菌之间的互作机制、了解寄主与病原菌之间的共进化规律。 由于含有Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-h及Pik-s等5个对水稻育种计划极为重要的稻瘟病抗性基因，位于第11染色体长臂末端的Pik位点一直备受关注。先前，其中的Pik-m及Pik-p已被成功克隆。为了揭示Pik基因家族的作用及进化模式，本研究针对Pik和Pik-h这2个基因开展了以下4个方面的工作，获得的主要结果如下： 1.稻瘟病抗性基因Pik的定位、克隆及功能研究 利用稻瘟病菌株CHL346、CHL2209及CHL2110，分别对携带有Pik基因的抗病亲本Kusabue与CO39、Kasalath、Bolun及IR36杂交获得的4个F2群体(W054、U234、U200及V4)进行接种鉴定，结果表明，品种Kusabue的稻瘟病抗性由单一显性基因位点控制。利用一系列来自Pik-m/Pik-p作图区域的SSR及CRG标记进行连锁分析，结果把Pik基因位点界定到与Pik-m及Pik-p的作图区域相重叠的166 kb区间中。 利用日本晴的参考序列进行候选基因预测，结果表明，该区间中存在着6个NBS-LRR类抗性基因，将它们分别命名为Pik1-NP～Pik6-NP。基于PCR技术的存在/缺失分析结果证明，Pik目的区域同样存在着Pik-m/Pik-p位点所具有的插入/缺失事件，导致Kusabue的基因组缺失了Pik1-NP～Pik4-NP这4个基因，因此，Pik5-NP与Pik6-NP成为最有可能的候选基因，且它们在Kusabue的基因组中的等位基因被命名为Pik-1与Pik-2。同时，品种Kusabue(Pik)、Tsuyuake(Pik-m)及K60(Pik-p)的基因组被定为K型基因组，而日本晴基因组被定为N型基因组。一系列的功能获得性及丧失性遗传互补实验证明，Pik抗性的表达需要Pik-1及Pik-2这2个基因的协同作用。因此，Pik与Pik-m及Pik-p形成真正的等位基因系列。 2.稻瘟病抗性基因Pik-h的定位、克隆及功能研究 将携带有Pik-h基因的抗病亲本K3与感病品种As20-1杂交，经稻瘟病菌株CHL346的接种鉴定，K3的稻瘟病抗性被证明由单一显性基因位点控制。通过运用上述的定位策略及候选基因分析方法，Pikh5-NP与Pikh6-NP被确定为最佳的候选基因，且它们在K3基因组中的等位基因被命名为Pikh-1及Pikh-2。同时，品种K3的基因组也被定为K型基因组。经一系列的功能获得性及丧失性遗传互补实验验证，Pik-h抗性的表达被证明同样需要成对的Pikh-1及Pikh-2基因的介导。因此，Pik-h也与Pik、Pik-m及Pik-p构成真正的等位基因系列。基于实时定量RT-PCR技术的基因表达分析结果表明，Pikh-1与Pikh-2的表达模式并不相同，前者为组成型表达，而后者的表达则受病原菌诱导。 3.Pik等位基因的分子进化研究 根据K型基因组中的功能性成对基因(K1、K2)，以及它们在N型基因组中的非功能性等位基因(N1、N2)的序列信息分别设计基因组的特异性引物，并利用它们对由668个水稻种质资源组成的5个不同进化时序的群体(野生稻、籼稻地方品种、粳稻地方品种、籼稻现代品种、粳稻现代品种)进行Pik位点的单元型(haplotype)多态性分析。结果表明，K1K2及N1N2是该位点的2个优势单元型，它们独立起源于水稻驯化之前，且在野生稻中均衡分布；但由于人工选择的影响，功能性的K1K2单元型在水稻的驯化过程中逐渐占据优势。 构建基于等位基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的基因树，以明确上述5个等位基因的分子进化关系。结果表明，在功能性的K1K2单元型中进一步存在2个亚单元型(subhaplotype)，即KM(Pik，Pik-m，Pik-s)与KH(Pik-p，Pik-h)型的分化。多序列比对结合SNP分析证明，2个亚单元型以及Pik位点5个等位基因的分化取决于8个特异性的SNP位点。利用这8个特异性SNP位点进一步对属于K1K2单元型的水稻种质资源进行大规模的筛选、调查，结果表明，KM与KH的亚单元型的分化同样存在于水稻驯化之前，但KH/KH亚单元型在2个籼稻亚种群体中的比例显著高于KM/KM亚单元型的。在所有的5个Pik等位基因中，Pik-h最为年轻，其产生于现代水稻栽培过程中；而Pik与Pik-m次之，它们出现于水稻驯化之后；Pik-p与Pik-s则比较古老，它们在水稻驯化之前便已存在。 系统进化分析显示，组成Pik等位基因的成对基因并非通过简单的复制事件由一方从另一方复制而来，且它们可能起源于禾本科植物的古老共同祖先。 4.Pik等位基因的互作研究 开展酵母双杂交(yeast two-hybrid，Y2H)实验以检测Pik-h成对蛋白(Pikh-1及Pikh-2)与其效应子AvrPik-h之间的互作，结果表明，Pikh-1通过其CC结构域与AvrPik-h及Pikh-2直接互作。Pull-down体外结合实验进一步验证了该结果。 利用水稻原生质体进行荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)实验，结果表明，全长Pikh-1与AvrPik-h及Pikh-2之间的互作发生于细胞质及细胞核中，从而呈现一种质核平衡的分布模式；而Pikh-1的CC结构域则打破了这种平衡，其与AvrPik-h及Pikh-2之间的互作只存在于细胞核中。 在异源的烟草瞬时表达系统中，仅仅Pikh-2的全长蛋白本身便能引发过敏性坏死反应(hypersensitive response，HR)；而基于荧光素酶报告基因的水稻原生质体瞬时表达实验则证明只有全长的Pikh-1及Pikh-2蛋白与效应子共表达时才能触发细胞死亡反应。 综合上述具原创性的研究结果，作者提出了双基因抗性系统的进化及工作模式。这为更加全面、深入地了解植物抗性的分子机制提供了新的视野和途径。