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生物荧光显微镜使用特定波长的激发光照射生物组织中的特定对象,使其标记的荧光物质发射荧光,进行结构性和功能性成像。在传统生物荧光显微镜中,整个生物组织的三维范围都被照射,位于焦平面以外的样本也会发射荧光,一方面影响成像的对比度和分辨率,另一方面会显著增加光漂白效应,使得系统可以连续成像的时间大大缩短。另外,传统生物荧光显微镜的照明光是可见光波段的连续激光,这种激光在生物组织中的传播过程中受到严重的吸收和散射,导致穿透深度很小,难以满足成像需求。为了解决传统生物荧光显微镜存在的以上问题,双光子光片显微镜应运而生。双光子光片显微镜将照明光由可见光波段的连续激光改为近红外波段的飞秒脉冲激光,近红外照明光受生物组织的吸收和散射影响小,使得照明深度增加。照明光在生物组织中聚焦并激发出双光子荧光,激发出的双光子荧光被局限在照明光焦点处而且比照明光焦点区域还要小,焦点以外的荧光不会被额外激发,在此基础上,通过扫描器件对照明光沿横向和照明深度方向进行快速扫描,即可在生物组织处产生双光子光片。因此,双光子光片显微镜的空间分辨率高,光漂白效应很低,逐渐成为活体组织成像的利器。随着脑神经科学领域的发展,生物医学研究人员对双光子光片显微镜的性能提出了更加全面的要求,系统需要在保持高分辨率、低光漂白效应的基础上达到600μm×600μm的成像视场。双光子光片显微镜在横向上的扫描由扫描振镜完成,通过设置其参数可以实现600μm的扫描范围;轴向(照明深度方向)上的扫描是通过超高速变焦透镜(TAG变焦透镜)对照明光光焦度的调节来完成,这种方式虽然能够实现双光子焦点的轴向移动,但是无法达到600μm的穿透深度。另外,由于活体生物组织是非均匀的光学介质,照明光传播至生物组织深处时会受到随机像差的影响而发生波前畸变,导致照明光穿透深度减小,严重减小了双光子光片的有效范围。因此,目前双光子光片显微镜的最大成像视场局限在170μm×170μm的范围内,难以满足全脑神经组织的成像需求。针对以上问题,本论文将自适应光学技术应用于双光子光片显微镜的照明光路中,展开以下研究内容:利用MATLAB对双光子光片的产生过程进行模拟,分析了不同像差对双光子光片厚度和强度产生的影响。结果表明,系统需要探测和校正的Zernike项数应不多于58项,为自适应光学系统的设计提供了基本依据。由于TAG变焦透镜无法实现轴向600μm穿透深度的调节,因此,提出双侧照明的光路结构,使得单侧照明深度要求从600μm降为300μm。但是,TAG变焦透镜仍然无法实现单侧300μm的照明深度,为此,提出利用液晶波前校正器(LCOS)辅助调焦的分区域照明方法:利用LCOS加载离焦像差实现双光子光片在照明深度方向上的移动,形成不同深度处的双光子光片子区域,不同子区域拼接配合成像相机的长时间曝光实现双光子光片在照明深度方向上的扩展,进而实现成像视场的扩展。分区域照明的方法一方面扩展了照明深度,另一方面使得超高速扫描条件下的自适应波前校正和波前探测成为可能。由于TAG变焦透镜的工作频率高达200kHz~400kHz,而波前探测器和波前校正器的工作频率只有1kHz左右,工作频率上的巨大差异使得波前探测和波前校正难以实现。为此,在分区域照明方法的基础上,基于等晕区的概念,提出利用同一个LCOS并行完成视场扩展和分等晕区像差校正的方法:将单侧照明视场分为18个等晕区,每个等晕区大小为100μm×100μm,等晕区在横向上的调节由扫描振镜完成,在轴向上的调节由LCOS加载离焦像差完成,在此基础上,等晕区内的扫描由扫描振镜和TAG变焦透镜完成,等晕区内的像差校正由LCOS完成,实现600μm×300μm范围内的扫描和校正需要的时间为36ms。对LCOS并行完成视场扩展和像差校正进行理论分析,得出LCOS像素数为512×512时即可满足300μm的轴向视场扩展和RMS=1.0λ的生物组织像差校正的需求。同时,提出在照明光路中应用双光子焦点作为探测信标配合解扫描技术的波前探测方法,将同一等晕区范围内的荧光信号进行解扫描叠加,实现探测信噪比的增强。如此一来,虽然扫描速度高达200kHz~400kHz,但是无需进行逐点的像差探测和校正,只需要在等晕区范围内进行一次探测和校正即可,大大降低了波前探测和波前校正的时间频率,使得波前探测器和波前校正器能够在超高速扫描条件下实现像差的探测和校正。对波前探测和波前校正进行实验,发现波前探测仍然无法完成,因为照明光路轴向扫描是通过调节光焦度实现的,而轴向不同位置的光进入哈特曼波前探测器时也会产生不同的离焦像差,使得波前探测发生混乱。因此,必须对波前探测时的轴向扫描方式进行改进。由于生物组织中像差的时间变化频率很低,变化周期以分钟或小时为单位,因此,将波前探测和波前校正分离,提出先探测像差、再存储像差、后校正像差的时序控制方法。像差探测时,关闭LCOS和TAG变焦透镜,利用压电陶瓷驱动器(PZT)带动照明物镜进行焦点的轴向扫描,以100μm×100μm的等晕区为单位进行解扫描波前探测,整个视场内的像差探测完成后再利用LCOS和TAG变焦透镜进行轴向扫描和校正成像。由此程序完成600μm×300μm视场的像差探测需要约200ms,仍然远小于生物组织中像差的变化周期,能够保证在像差不变的情况下完成后续的波前校正。基于以上研究,设计了双光子光片显微镜的液晶自适应光学成像系统,完成了系统光学设计和优化。基于系统结构稳定、便携等因素的考虑,对系统的机械结构进行了优化,优化后的系统集成在750mm×650mm大小的平台上。最后,搭建了整套双光子光片显微镜的液晶自适应光学成像系统,并利用搭建的系统进行自适应探测和校正成像的实验验证。制备了若丹明6G荧光染料染色的斑马鱼活体胚胎样本,实现了照明光路轴向300μm深度的双光子光片视场拼接和像差校正,实现了斑马鱼组织的液晶自适应光学校正成像,校正前后的成像分辨率和信噪比得到了显著提升。本论文属于液晶自适应光学在双光子光片显微镜中应用的开创性工作,通过对生物组织中随机像差的探测和校正形成兼具高时空分辨率、大成像视场、大成像深度、低光漂白的显微成像系统,使得活体生物组织的长时间大视场高分辨率成像成为可能。