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犬细小病毒病(Canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(CPV)引起犬的一种急性传染病,该病在临床上主要表现为发热、呕吐、出血性肠炎、白细胞减少和幼犬心肌炎。目前,免疫接种是防治该病的主要措施。近年来,由于疫苗抗原性差异,幼犬母源抗体干扰,免疫犬抗体水平过低导致免疫失败,引发CPV感染的报道不断出现。因此,定期分离当地的CPV流行毒株,分析其抗原性遗传演变情况,及时了解幼犬CPV母源抗体水平和免疫犬抗体水平,确定最佳的疫苗免疫时机,对于犬细小病毒的防控具有重要意义。本研究将临床疑似感染CPV的病犬排泄物处理后接种F81细胞,传代培养后,经电镜观察、间接免疫荧光技术、PCR、血凝(HA)鉴定确定分离获得1株CPV病毒,命名为CPV-DN17-1。克隆CPV分离株VP2基因,测序结果与GenBank中收录的CPV疫苗株、国内外分离株等24株CPV VP2序列进行比对分析,结果显示,分离株与疫苗株同源性存在差异,核苷酸同源性为95.6%~98.8%;与国内外分离株差异不大,核苷酸同源性为98.7%~99.8%;与HRB-e2(哈尔滨分离株)氨基酸同源性为100%,其它毒株为97.9%~99.4%。系统进化树分析结果显示,病毒分离株与疫苗株、国外分离株、其它种属细小病毒亲缘关系均较远,与国内分离株较近,表明分离株不是来源于疫苗株。与CPV参考株的氨基酸序列比对显示,分离株基因型为new CPV-2a型;分离株与疫苗株相比较,主要抗原表位区氨基酸没有明显的改变。本研究根据DNAStar-Protein软件分析以及参考相关文献,在CPV-DN17-1的VP2基因主要抗原表位编码区设计并合成两对引物sVP2-F1/R1和sVP2-F2/R2,克隆并构建了重组质粒pGEX-VP2-S1和pGEX-VP2-S2。诱导、表达和鉴定后的重组蛋白命名rVP2-S1和rVP2-S2。用重组蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、中和试验检测,rVP2-S1的间接ELISA效价为1:12800,中和效价为1:128;rVP2-S2的间接ELISA效价为1:6400,中和效价为1:54。选择免疫原性更好的rVP2-S1致敏红色聚苯乙烯羧基纳米微球,对致敏蛋白浓度、致敏缓冲液、EDC含量等致敏条件的优化结果表明,当纳米微球为25μL(5%w/v),致敏蛋白量0.3 mg,EDC 0.015 g,醋酸缓冲液500μL时,致敏的彩色微球与兔抗CPV阳性血清凝集效果最佳。凝集结果经试剂盒标定,判定标准为能使致敏微球发生50%(++)以上凝集的血清为阳性血清,该血清抗体对犬有免疫保护作用;低于50%凝集为阴性结果,血清抗体无免疫保护作用。试验证明该方法特异性、敏感性、重复性和稳定性良好。利用建立的检测方法和试剂盒同时对临床采集的40份犬血清进行检测,符合率为97.5%。本研究所建立的CPV抗体检测间接凝集试验具有良好的特异性、敏感性、稳定性,可满足临床对单份血清的检测需求,具有明显的应用价值。