论文部分内容阅读
卵母细胞的体外成熟(in vitro Maturation, IVM)技术和胚胎体外培养(in vitro Culture, IVC)是生殖生物学中的关键技术,在畜牧业生产中有广泛的应用。为了提高牛卵母细胞体外成熟质量以及提高早期胚胎发育的质量,本论文研究了减数分裂抑制剂C型钠肽(C-type natriuretic peptide, CNP)预处理牛卵母细胞后对卵母细胞的成熟质量的影响,同时研究了不同氧气浓度对胚胎细胞凋亡的影响以及父源与母源性印记基因在牛早期胚胎体外发育过程中的差异性表达。本研究得到以下几点结论:1、以常规的牛卵母细胞体外成熟24h为对照,研究了CNP预处理牛卵母细胞6h,再进行成熟培养28h后的成熟情况。发现经CNP预处理组获得的成熟卵母细胞,从线粒体分布、线粒体DNA拷贝数水平以及受精后胚胎发育成囊胚的质量均优于常规成熟的卵母细胞,表明C型钠钛预处理可以有效改善牛卵母细胞体外成熟的质量。2、分别检测了常规方法成熟卵母细胞和CNP预处理组的成熟卵母细胞的ROS水平和GSH浓度,结果显示利用C-型钠肽对牛卵母细胞预处理6h然后体外成熟28h会导致牛卵母细胞内ROS水平的提高,但是,由于GSH在此过程中对活性氧的清除作用保护了卵母细胞的受精能力及受精后胚胎的发育能力。表明利用CNP预处理进行的牛卵母细胞两步成熟过程没有引起卵母细胞老化。3、研究了不同氧气浓度对牛早期胚胎细胞的凋亡以及凋亡基因表达水平的影响,结果表明在低氧环境中培养的胚胎的凋亡水平明显低于高氧环境中的胚胎,表明低氧环境更有利于牛体外受精胚胎的发育;并且培养环境中的氧气浓度在一定程度上影响了牛胚胎细胞中凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达,这些基因表达产物可能相互协同影响了胚胎细胞凋亡的发生。4、利用Real-time PCR技术分别检测三个父源性印记基因Gnas、Grb10、Xist和三个母源性印记基因Mage12、Sgce和SNRPN在牛孤雌激活(Parthenogenetic Activation, PA)胚胎和体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)胚胎中的表达水平。结果显示在IVF和PA胚胎发育过程中,父源性印记基因和母源性印迹基因表达模式存在一定的差异,这对牛早期胚胎的正常发育可能发挥重要作用。总之,以C型钠钛预处理为基础的两步成熟法可以有效改善牛卵母细胞的体外成熟质量;低氧环境降低了牛胚胎体外发育过程凋亡的发生,更有利于牛体外受精胚胎的发育;牛早期胚胎的正常发育是培养环境、凋亡基因和印记基因等基因相互协同的结果。