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研究背景：
脑梗死是中老年人常见病、多发病,具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点,而且发病率呈上升及年轻化趋势,严重危及人类健康,给个人、家庭和社会带来沉重的负担。随着神经影像技术的飞速发展,脑梗死临床诊断水平有了质的飞跃,但治疗形势仍非常严峻,目前除了超早期溶栓治疗的有效性得到肯定之外,仍缺乏其他确实可靠的临床特效治疗,但溶栓治疗受到严格适应症的限制,特别是治疗时间窗的限制,而且溶栓治疗也有一定继发性出血的风险,故真正能从溶栓治疗中获益的脑梗死患者比例非常小。造成脑梗死治疗困难,致死、致残率高的重要因为之一是对脑梗死病理生理等发病机制仍缺乏深入了解。因此,通过研究脑梗死的发病机制来探索新的有效治疗策略成为脑梗死研究领域的当务之急。
目前,有关脑梗死方面的研究无论是临床研究还是基础研究,都主要集中在如何减轻梗死灶局部的神经组织损伤和增强缺血周围组织的代偿能力,从而改善神经功能,但对脑梗死后远隔部位的继发性损害极少关注。尸体解剖()动物实验和神经影像学研究均发现:局灶性大脑皮层梗死后不仅导致相应供血区的脑组织神经细胞死亡,而且对非缺血的但与原发病灶有着突触联系的远隔部位(例如:丘脑、黑质、脊髓等)也可以引起继发性损害,并影响神经功能的恢复。因为丘脑不属于大脑中动脉供血区,大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occulusion,MCAO)后同侧丘脑继发性损害是局灶性脑梗死后继发性远隔损害的典型代表,也是该领域的研究热点。脑梗死后远隔部位继发性损害的具体发生机制目前尚未完全阐明。
β淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)是阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)特征性病理改变老年斑的主要成份。Aβ是公认的神经毒性分子,它在脑内异常沉积对AD发病起核心作用。Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β-和γ-分泌酶水解后产生的,抑制β-或γ-分泌酶均能有效减少Aβ生成。因为γ-分泌酶是APP水解产生Aβ的最后一步,也是决定Aβ变体长度的关键,所以γ-分泌酶抑制剂被认为是治疗AD很有前景的药物。N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S—phenylglycine t-butyl ester(DAPT)是γ-分泌酶抑制剂的一种,具有高度选择性,研究发现口服DAPT能有效降低动物血浆、脑脊液及大脑皮质或海马Aβ水平,且呈剂量依赖性,并能显著改善AD小鼠的认知功能。近年来,研究发现Aβ在脑内的异常沉积并非AD所特有,MCAO后不仅梗死灶周边有Aβ异常沉积,而且同侧丘脑也有Aβ异常沉积现象,但Aβ在丘脑沉积后的作用目前仍不清楚。
建立在易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke—prone renovascular hypertensiverats,RHRSP)基础上的电凝法局灶性大脑皮层梗死模型(MCAO)不仅能较好地模拟临床上脑卒中的高血压危险因素,而且高血压大鼠侧支循环较正常血压鼠更差,可复制出高梗死发生率的局灶性脑梗死模型。此外,电凝法MCAO模型的梗死灶局限于大脑皮层,不影响后循环的血供,所以利用该模型来研究MCAO后远隔丘脑部位继发性损害具有独特优势。
研究目的：
本课题分为两部分:第一部分,在RHRSP基础上建立MCAO模型,动态观察Aβ表达情况,探讨MCAO后Aβ表达的变化规律:第二部分,利用γ-分泌酶抑制剂(DAPT)进行干预,观察比较干预组与对照组之间丘脑Aβ沉积、丘脑继发性损害程度以及神经功能的差异,探讨Aβ异常沉积是否对丘脑具有损害作用及对神经功能的影响。
材料和方法：
第一部分:高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后Aβ表达的动态观察
选取体重70～90 g雄性SD大鼠70只按双肾双夹法复制成RHRSP模型并监测血压。RHRSP术后12 w,选取血压稳定高于180 mmHg,且无明显脑卒中征象的高血压大鼠53只,按电凝法成功复制左侧MCAO模型30只,另随机选取18只作为假手术组,该两大组又随机分为6个小组,每小组含MCAO组5只,假手术组3只,分别在MCAO或假手术后24 h、2 d、3 d、7 d、21 d、28 d处死,其中术后24 h组用于2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色以明确梗死灶分布,其余时间点均用于Aβ免疫组织化学检查,以及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫荧光双标以观察Aβ表达及其与细胞共定位情况。
第二部分:高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑Aβ沉积与继发性损害研究
选取体重70～90 g雄性SD大鼠60只按双肾双夹法复制成RHRSP模型并监测血压。RHRSP术后12 w,选取血压稳定高于180 mmHg,且无明显脑卒中征象的高血压大鼠52只,按电凝法成功复制左侧MCAO模型36只,随机分为MCAO组、溶剂对照组和DAPT组,每组12只,另随机选取12只作为假手术组。MCAO术后72 h,DAPT组大鼠经一次性灌胃给予DAPT溶液[50 mg/kg,溶剂为5％(体积比)酒精玉米油溶液,总体积为10 ml/kg]；溶剂对照组大鼠给予等体积不含DAPT的溶剂:MCAO组和假手术组大鼠不给予任何灌胃处理。MCAO术后7 d采用粘贴物移除实验和提高后躯体摆动实验分别对感觉和运动功能进行评价,神经功能评价结束后分别从每组随机选取8只大鼠进行灌注取脑冰冻切片,Nissl染色观测梗死灶体积和丘脑组织学变化,免疫组织化学检查观测丘脑Aβ沉积程度以及丘脑腹后核(ventroposterior nucleus of the thalamus,VPN)NeuN和OX-42免疫阳性细胞数；每组剩余的4只大鼠进行灌注取丘脑提取总Aβ x-42蛋白用于酶联免疫吸附实验(enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA)检测丘脑Aβ x-42水平。
除丘脑Aβ免疫阳性面积以中位数(四分位间距)表示,并采用非参数检验(Kruskal—Wallis test followed by Mann-Whitney U test)进行多组间比较外,其余数据均以均数±标准误表示,并采用Student-t test进行两组间比较,单因素方差分析(ANOVA followed by Bonferroni test)进行多组问比较。此外,对MCAO术后7 d同侧丘脑VPN内神经元数量与大鼠的右前肢感觉、运动功能评分或同侧丘脑Aβ免疫阳性面积之间的相关关系进行Spearman相关分析。所有数据均采用SPSS13.0 for windows进行统计分析,P<0.05为有统计学差异。
结果：
一、第一部分结果
1、TTC染色
假手术组全脑组织均呈红色着色:MCAO组术后24 h除左侧额、颞、项区未着色外其余脑组织呈红色着色。
2、Aβ免疫组织化学及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫荧光双标检查
假手术组全脑组织在各时间点均未见Aβ免疫阳性信号；MCAO组术后在梗死灶周边和同侧丘脑均有Aβ表达,并具有以下3个特点:
2.1 Aβ表达时间及表达量变化:在梗死灶周边:MCAO术后2 d细胞内出现Aβ免疫强阳性信号；3 d时细胞内Aβ免疫阳性信号有所减弱,细胞外出现少量Aβ免疫阳性信号；7 d时Aβ免疫阳性细胞数量明显减少,细胞内Aβ免疫阳性信号也进一步减弱,但细胞外Aβ免疫阳性信号明显增加；28 d时Aβ免疫阳性信号以细胞内为主,细胞外几乎消失。在同侧丘脑:MCAO术后2 d未见Aβ免疫阳性信号,3 d时出现少量表达,7 d时表达量明显增加,而且一直持续至28 d。
2.2 Aβ免疫阳性信号空间分布特点:在梗死灶周边:MCAO术后2 d免疫荧光双标示Aβ主要分布于神经元内；3 d至21 d时Aβ在神经元内和细胞外均有分布；28 d时Aβ主要分布于星型胶质细胞内。在同侧丘脑:Aβ均分布于VPN区,除了在MCAO术后28 d时有少量Aβ分布于小胶质细胞内之外其余均分布于细胞外。
2.3 Aβ免疫阳性信号形态学特点:在梗死灶周边细胞外的Aβ形状一直呈细小颗粒状；而在同侧丘脑7 d内也呈细小颗粒状,至21 d时部分仍呈细小颗粒状,但部分聚集成小斑块状,28 d时以斑块状为主,且斑块直径比21 d明显增大。
二、第二部分结果
1、血压
RHRSP术后12 w大鼠血压(193.25±9.82 mmHg)明显高于RHRSP术前1w的基础血压(103.45±11.99 mmHg,P<0.01)。MCAO术前1 d和MCAO术后7 d,假手术组、MCAO组、溶剂对照组和DAPT组之间血压均无统计学差异(P均>0.05)。
2、神经功能评价
MCAO术前假手术组、MCAO组、溶剂对照组和DAPT组大鼠双侧前肢粘贴物平均移除时间均无统计学差异(P均>0.05)；MCAO术后7 d,MCAO组、溶剂对照组和DAPT组大鼠右前肢粘贴物平均移除时间均比假手术组明显延长(分别为:30.3±3.9,27.9±4.4,22.9±4.8,6.4±1.6 s,P均<0.01),但DAPT组明显比溶剂对照组更短(P<0.05)。四组大鼠左前肢粘贴物平均移除时间与术前相比均无统计学差异(P均>0.05)。MCAO术前四组大鼠提高后躯体摆动实验发现向左右偏转的百分比无统计学差异(P均>0.05)；MCAO术后7 d,MCAO组、溶剂对照组和DAPT组大鼠向右侧偏转的百分比均明显比假手术组高(分别为:90.6±9.8％,87.5±10.7％,81.9±13.3％,53.8±15.1％,P均<0.01),但DAPT组与溶剂对照组之间无统计学差异(P>0.05)。
3、Nissl染色
MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组脑梗死体积占对侧半球的相对百分比分别为15.64±2.15％,14.69±2.08％和13.08±3.20％,三组之间无统计学差异(P>0.05)。MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组同侧丘脑VPN完好神经元数量比假手术组明显减少(分别为:40.62±5.09,43.13±4.51,52.98±9.95,71.17±4.54个/400倍视野,P均<0.01),但DAPT组与溶剂对照组相比完好神经元数量明显增多(P<0.05)。
4、丘脑Aβ、NeuN、OX-42免疫组织化学检查
假手术组全脑组织未见Aβ免疫阳性信号。MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组同侧丘脑Aβ免疫阳性面积比假手术组明显增加,均具有统计学差异(P均<0.001),DAPT组与溶剂对照组相比同侧丘脑Aβ阳性面积降低50.7％(P<0.001)。
MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组同侧丘脑VPN NeuN免疫反应阳性细胞计数分别为:37.6±5.2,38.6±4.6,51.1±5.9个/400倍视野,均明显少于假手术组(63.3±6.6个/400倍视野,P均<0.01),但DAPT组比溶剂对照组明显更多(P<0.05)。
MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组同侧丘脑VPN OX-42免疫反应阳性细胞计数分别为:79.1±3.3,75.4±5.8,49.7±5.9个/400倍视野,均明显多于假手术组(17.6±2.0个/400倍视野,P均<0.01),而且OX-42免疫反应阳性细胞体积较大,突触明显增多,呈活化状态,但DAPT组与溶剂对照组相比OX-42免疫反应阳性细胞数量明显更少(P<0.05)。
5、丘脑Aβx-42酶联免疫吸附实验
MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT组同侧丘脑Aβx-42水平明显高于假手术组(分别为:1017.25±135.15,952.65±154.23,530.73±145.39和22.23±5.65 pg/mg,P均<0.001)。DAPT组与溶剂对照组相比降低了同侧丘脑Aβ x-42量为41.47％(P<0.001)。
6、相关分析
MCAO术后7 d MCAO组、溶剂对照组和DAPT这三组缺血大鼠同侧丘脑VPN完好神经元数量(Nissl染色)或NeuN免疫反应阳性细胞数量(NeuN免疫组织化学染色)均与对应三组大鼠右前肢粘贴物平均移除时间呈明显负相关(r分别为-0.872和-0.891,P均<0.001)。同样,三组缺血大鼠同侧丘脑VPN完好神经元数量或NeuN免疫反应阳性细胞数量均与对应三组大鼠同侧丘脑Aβ免疫阳性面积呈明显负相关(r分别为-0.789和-0.755,P均<0.001)。但是,三组缺血大鼠同侧丘脑VPN神经元数量与右前肢运动评分之间无明显相关关系(P均>0.05)。
结论：
1、RHRSP大鼠局灶性大脑皮层梗死后梗死周边和同侧丘脑存在Aβ的动态表达,其中在梗死周边表达为一过性,早期表达于神经元内,然后释放到细胞外,后期被胶质细胞吞噬清除；而在同侧丘脑呈持续性,一直沉积于细胞外;
2、RHRSP大鼠局灶性大脑皮层梗死后Aβ表达在梗死周边与缺血有关,而在同侧丘脑与直接缺血无关；
3、局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑Aβ沉积对丘脑具有损害作用；
4、口服γ分泌酶抑制剂可减少局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑Aβ沉积,从而减轻丘脑继发性损害；
5、减轻局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑的继发性损害可改善感觉功能。