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目的：
通过灌注法制备肝素、VEGF交联改性的去细胞全肾生物支架，对改善作为组织工程支架材料的去细胞肾支架的生物相容性及抗凝性能进行了初步研究，以期望将此方法用于探索修饰后的去细胞肾支架的生物学特征。
方法：
1实验分组
取健康雄性SD大鼠120只，随机分为4组，每组30只。第一组（D组）：去细胞肾支架；第二组（H组）：去细胞肾脏支架交联肝素；第三组（V组）：去细胞肾支架交联内皮细胞生长因子；第四组（H+V组）：去细胞肾支架交联肝素后再交联内皮细胞生长因子。
2制备去细胞肾脏支架
采用SD大鼠经腹主动脉插管灌注，依次灌注TritonX-100、SDS等去污剂，制备SD大鼠去细胞肾脏支架（DKS）。在此基础上继续依次灌注已经过EPA方式预处理过的肝素纳溶液、VEGF溶液及含有双抗（青霉素-链霉素）的去离子水，再将制备完成的去细胞肾脏支架浸泡于含有双抗的PBS中，于4℃冰箱中存储备用。
3病理学观察
（1）观察去细胞肾脏支架外形及颜色差异变化；
（2）通过HE染色、Masson染色及DNA检测,观察去细胞肾支架胶原纤维微结构及去细胞肾支架内的细胞成分是否去除；
（3）通过免疫荧光染色（IF）及扫描电镜（SEM）观察去细胞肾支架内胶原形态的保留和细微结构的完整性。
4生物力学结构稳定性检测
生物力学检测包括：极限抗张强度（Mpa）、断裂伸长率（%）及弹性模量检测,以此检测各组支架的生物力学性能。
5抗凝性观察
（1）甲苯胺蓝染色观察去细胞肾支架是否成功交联肝素；
（2）通过血小板黏附实验和血小板计数，检测肝素化去细胞肾支架的肝素化效果和抗凝血性能；
（3）甲苯胺蓝比色法定量检测肝素的结合率和释放率。
6通过ELISA定量检测各组支架内的VEGF含量和释放率。
7通过细胞共培养和MTS分析检测细胞相容性。
8通过动物体内移植，在相应的天数后取出移植物，进行HE染色和免疫组化染色，图像采集完后通过血管计数，来检测组织相容性。
结果：
通过大体观察，可见去细胞肾支架保存肾脏原有外形，D组和V组的肾支架均呈半透明白色，稍有塌陷，H组和H+V组形态较未交联肝素前更立体、颜色呈乳白色。
经过HE染色、Masson染色及免疫荧光染色观察可见各组支架细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）结构完整，胶原无断裂，肾小球、血管轮廓结构清晰可见，纤维及基膜等结构的完整性，且DNA检测显示去细胞肾支架内DNA含量极低，位于正常去细胞肾支架范围内。通过扫描电镜（SEM），发现未交联组和交联组去细胞肾支架上未见细胞残留，胶原纤维连续，无断裂，肾小球结构清晰可见，但交联组支架上未观察到相应的药物颗粒附着。
肝素交联后的肾支架，其力学性能得到了有效提高。通过生物力学检测发现，H组的极限抗张强度（Mpa）、断裂伸长率（%）及弹性模量都远高于D组，而且更接近于正常的肾脏组织。
在观察肾支架的抗凝性时，甲苯胺蓝（TB）染色显示，去细胞肾支架成功交联上与肝素。在血小板黏附实验中，通过扫描电镜（SEM）及图像计数显示，H组支架上未见明显血小板黏附情况，而D组支架上布满了血小板。通过甲苯胺蓝比色法对支架进行肝素定量检测发现，H组无论在96小时的累积还是持续释放后，与原始肝素含量相比，都能够将60％左右的肝素保留在去细胞肾支架中。
通过ELISA试剂盒定量检测可知，去细胞支架中的内皮细胞生长因子（VEGF）含量明显低于正常肾组织，但经过交联的H+V组的VEGF含量接近于正常肾组织。此外，在所有的时间点上，H+V组体外释放的VEGF量（n=3/时间点/组）均大于V组。
细胞共培养和MTS检测表明，相比于其他组，H+V组更能促进人类脐静脉内皮细胞在其支架上分布、粘附和增殖,但与H组无明显差异。各组支架分别与人脐静脉内皮细胞共培养48h后进行免疫荧光染色显示，细胞均能良好的粘附于支架生长并增殖，这表明各组支架具有良好的细胞相容性，其中H+V组的细胞密集程度明显高于其他组。
肾被囊下包埋结果显示，含有肝素的修饰组在第7天明显可见新生血管，并逐渐向移植支架中心区域延伸；其新生血管数量明显高于未经肝素修饰组；14天以后可见肝素化移植物内形成血管化网状组织。
结论：
通过血管灌注法制备的去细胞肾支架，其支架内的细胞成分完全去除，且细胞外基质结构保存完好。与单纯去细胞肾支架相比较，灌注经过EPA方法处理过的肝素交联的去细胞肾支架，具有更为立体的外形、和更稳定的生物力学性能，且具备良好的抗凝性能和生物相容性，能够结合并缓慢释放生长因子，更好的促进去细胞肾支架的血管再生。
通过灌注法制备肝素、VEGF交联改性的去细胞全肾生物支架，对改善作为组织工程支架材料的去细胞肾支架的生物相容性及抗凝性能进行了初步研究，以期望将此方法用于探索修饰后的去细胞肾支架的生物学特征。
方法：
1实验分组
取健康雄性SD大鼠120只，随机分为4组，每组30只。第一组（D组）：去细胞肾支架；第二组（H组）：去细胞肾脏支架交联肝素；第三组（V组）：去细胞肾支架交联内皮细胞生长因子；第四组（H+V组）：去细胞肾支架交联肝素后再交联内皮细胞生长因子。
2制备去细胞肾脏支架
采用SD大鼠经腹主动脉插管灌注，依次灌注TritonX-100、SDS等去污剂，制备SD大鼠去细胞肾脏支架（DKS）。在此基础上继续依次灌注已经过EPA方式预处理过的肝素纳溶液、VEGF溶液及含有双抗（青霉素-链霉素）的去离子水，再将制备完成的去细胞肾脏支架浸泡于含有双抗的PBS中，于4℃冰箱中存储备用。
3病理学观察
（1）观察去细胞肾脏支架外形及颜色差异变化；
（2）通过HE染色、Masson染色及DNA检测,观察去细胞肾支架胶原纤维微结构及去细胞肾支架内的细胞成分是否去除；
（3）通过免疫荧光染色（IF）及扫描电镜（SEM）观察去细胞肾支架内胶原形态的保留和细微结构的完整性。
4生物力学结构稳定性检测
生物力学检测包括：极限抗张强度（Mpa）、断裂伸长率（%）及弹性模量检测,以此检测各组支架的生物力学性能。
5抗凝性观察
（1）甲苯胺蓝染色观察去细胞肾支架是否成功交联肝素；
（2）通过血小板黏附实验和血小板计数，检测肝素化去细胞肾支架的肝素化效果和抗凝血性能；
（3）甲苯胺蓝比色法定量检测肝素的结合率和释放率。
6通过ELISA定量检测各组支架内的VEGF含量和释放率。
7通过细胞共培养和MTS分析检测细胞相容性。
8通过动物体内移植，在相应的天数后取出移植物，进行HE染色和免疫组化染色，图像采集完后通过血管计数，来检测组织相容性。
结果：
通过大体观察，可见去细胞肾支架保存肾脏原有外形，D组和V组的肾支架均呈半透明白色，稍有塌陷，H组和H+V组形态较未交联肝素前更立体、颜色呈乳白色。
经过HE染色、Masson染色及免疫荧光染色观察可见各组支架细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）结构完整，胶原无断裂，肾小球、血管轮廓结构清晰可见，纤维及基膜等结构的完整性，且DNA检测显示去细胞肾支架内DNA含量极低，位于正常去细胞肾支架范围内。通过扫描电镜（SEM），发现未交联组和交联组去细胞肾支架上未见细胞残留，胶原纤维连续，无断裂，肾小球结构清晰可见，但交联组支架上未观察到相应的药物颗粒附着。
肝素交联后的肾支架，其力学性能得到了有效提高。通过生物力学检测发现，H组的极限抗张强度（Mpa）、断裂伸长率（%）及弹性模量都远高于D组，而且更接近于正常的肾脏组织。
在观察肾支架的抗凝性时，甲苯胺蓝（TB）染色显示，去细胞肾支架成功交联上与肝素。在血小板黏附实验中，通过扫描电镜（SEM）及图像计数显示，H组支架上未见明显血小板黏附情况，而D组支架上布满了血小板。通过甲苯胺蓝比色法对支架进行肝素定量检测发现，H组无论在96小时的累积还是持续释放后，与原始肝素含量相比，都能够将60％左右的肝素保留在去细胞肾支架中。
通过ELISA试剂盒定量检测可知，去细胞支架中的内皮细胞生长因子（VEGF）含量明显低于正常肾组织，但经过交联的H+V组的VEGF含量接近于正常肾组织。此外，在所有的时间点上，H+V组体外释放的VEGF量（n=3/时间点/组）均大于V组。
细胞共培养和MTS检测表明，相比于其他组，H+V组更能促进人类脐静脉内皮细胞在其支架上分布、粘附和增殖,但与H组无明显差异。各组支架分别与人脐静脉内皮细胞共培养48h后进行免疫荧光染色显示，细胞均能良好的粘附于支架生长并增殖，这表明各组支架具有良好的细胞相容性，其中H+V组的细胞密集程度明显高于其他组。
肾被囊下包埋结果显示，含有肝素的修饰组在第7天明显可见新生血管，并逐渐向移植支架中心区域延伸；其新生血管数量明显高于未经肝素修饰组；14天以后可见肝素化移植物内形成血管化网状组织。
结论：
通过血管灌注法制备的去细胞肾支架，其支架内的细胞成分完全去除，且细胞外基质结构保存完好。与单纯去细胞肾支架相比较，灌注经过EPA方法处理过的肝素交联的去细胞肾支架，具有更为立体的外形、和更稳定的生物力学性能，且具备良好的抗凝性能和生物相容性，能够结合并缓慢释放生长因子，更好的促进去细胞肾支架的血管再生。