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The Mab-21基因——从秀丽隐杆线虫中被最早鉴定出来的一个高度保守的基因,目前已鉴定出的Mab-21基因有两个:Mab-2111和Mab-2112。在脊椎动物中,这两个基因编码的氨基酸序列存在90%以上的同源性,因此二者的功能也存在冗余和交叉现象。早期的研究发现Mab2112基因调控着原肠胚、神经管的形成,在调节眼睛分化中也起着非常重要的作用。The Mab-2111的表达依赖于另一个重要的调节发育的转录因子——Pax6。Foxe3是一个调节晶状体发育的重要转录因子。在小鼠中敲除Mab-2111基因将使Foxe3基因表达水平显著下调。本论文所关注的Mab-2112基因在脊椎动物发育早期都有表达。Mab-2112基因还作为负性调节因子,在调节Rx2以及视网膜生成过程中起着举足轻重、不可替代的重要作用。
本课题以HLE细胞系作为实验材料,研究Mab-2112对HLE细胞凋亡的影响,主要实验方法及结果如下:
1.用OA分别处理HLE-vector和HLE-12两种细胞24小时、48小时。用血球计数器进行细胞计数,并估算出处理24小时、48小时的凋亡率。HLE-vector细胞在处理24小时时凋亡率为约20%,而HLE-12只有10%左右。待处理到48小时HLE-vector达到60%,而HLE-12大概维持在30%。由此可以看到,虽然在OA处理后,HLE-vector细胞和HLE-12细胞的数目都有所减少,但HLE-L2细胞的凋亡速率一直低于HLE-vector细胞。
2.对处理0小时、3小时、6小时的两种细胞进行Hoechst染色,在荧光显微镜中可以观察到,OA处理HLE-vector细胞6h时,凋亡比HLE-12较明显,说明HLE-12细胞相比于空载体细胞系HLE-vector凋亡延迟。流式结果显示,到处理48小时时HLE-vector细胞已经基本都处于凋亡的状态,而HLE-12很多细胞虽然也呈现凋亡的状态,但是仍有相当一部分细胞存活。这在一定程度上,反应出了Mab2112对细胞抗凋亡的重要作用。
3.利用RT-PCR技术和western blot技术,对内源性凋亡途径相关基因Bak的RNA水平和蛋白水平的表达进行了检测。通过RT-PCR方法检测RNA表达水平结果显示:在对照系中,从6小时开始,Bak的RNA水平即已开始增加,24小时时表达量已经非常高;而过表达系中Bak的RNA水平却一直维持比较低的水平。这表明,Mab2112基因可以延迟Bak mRNA水平的表达。Western blot检测蛋白水平结果显示:在HLE-12细胞中,OA处理后,Bak急剧下调,且一直维持在很低的表达水平;而在HLE-vector细胞中,Bak的表达一直维持很高的水平,在处理24小时时,表达水平达到最高。Western bolt结果表现出在蛋白水平上,Mab2112对Bak蛋白表达的强烈抑制作用。
综上所述,Mab2112基因可以抑制Bak的表达,而Bak蛋白在内源性细胞凋亡过程中起到非常重要的作用,可以通过穿过线粒体外膜、改变其线粒体通透性、促使线粒体释放细胞色素C激活一系列的凋亡相关激酶反应促进细胞凋亡。所以,我的论文结果表明Mab2112基因的新功能——抑制细胞凋亡,且其机制是通过负性调节Bak。