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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病,该研究采用基因工程手段,克隆了人野生型Parkin基因的全长cDNA,构建了人野生型Parkin基因的真核表达质粒,筛选获得稳定过表达人Parkin基因的PC12细胞克隆;观察Parkin基因过表达能否影响蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的细胞凋亡和胞浆内包涵体生成;建立了Parkin基因小干扰RNA的质粒表达系统,通过瞬时转染PC12细胞鉴定它们抑制Parkin基因表达的效果,为Parkin基因的功能研究提供一种新的knockdown细胞模型;筛选获得稳定抑制Parkin基因表达的PC12细胞克隆,初步探讨了Parkin基因功能缺陷对于PC12细胞的活力、氧化应激反应以及蛋白酶体抑制剂毒性易感性的影响,为进一步的研究奠定基础.该研究表明:1.成功构建了人野生型Parkin基因的真核表达载体pCDNA3.1/Parkin,并且筛选获得了稳定高表达人Parkin基因的PC12细胞克隆.2.Parkin基因过表达能够显著抑制蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导的PC12细胞凋亡,减少caspase 3的活化;能够促进lactacystin引起的无细胞毒性的泛素/Vimentin免疫阳性包涵体的生成.提示Parkin基因可能具有细胞保护作用,可能在帕金森病患者Lewy小体生成过程中发挥重要作用.3.建立了三种针对大鼠Parkin基因的小干扰RNA质粒表达系统;通过在PC12细胞中的瞬时表达,证实它们能显著抑制内源性Parkin基因的蛋白质表达;为Parkin基因的功能研究提供一种新颖实用的knockdown细胞模型.4.利用Parkin基因的小干扰RNA质粒表达系统,建立了稳定抑制Parkin基因表达的PC12细胞模型;体外实验显示Parkin基因表达下调能损伤多巴胺能细胞的抗氧化和自由基清除机制;能使多巴胺能细胞对于蛋白酶体抑制剂的毒性作用更为敏感.