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近年来,深部真菌感染明显增加,其中白念珠菌是深部真菌感染中最为常见的致病菌。由于三唑类抗真菌药物尤其是氟康唑(Fluconazole)疗效确切,耐受性好,因而在临床上广泛应用。随着氟康唑长疗程使用,因出现耐药株而导致治疗失败的报道与日俱增。目前已确定的白念珠菌主要耐药机制包括：主要易化载体超家族蛋白MDR1基因的过表达；编码ABC转运蛋白的CDR1,CDR2基因的高表达；药物作用靶酶基因ERG11的高表达和突变等。CAP1基因编码的Caplp是MDR1的转录激活因子,在白念珠菌的氧化应激反应中发挥重要的调控的作用。TAC1基因编码的Taclp是CDR1,CDR2的重要转录激活因子。CAP1可介导MDR1基因的上调和持续性高表达,而TAC1可介导CDR1、CDR2基因的上调和持续性高表达,最终产生耐药性。
本课题研究的目的是明确长海医院自临床患者中分离的白念珠菌对氟康唑等抗真菌药物产生耐药性的分子机制,了解菌株产生耐药性的内在原因,寻找对这些耐药菌株耐药性产生的重要的分子机制,为预测菌株耐药性产生奠定理论基础。
采用微量液基稀释法测定氟康唑对临床分离白念珠菌的最低抑菌浓度；以筛选出敏感菌株和耐药菌株；实时定量PCR(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR)方法检测耐药相关基因CDR1,CDR2,MDR1,ERG11,转录调控因子CAP1及TAC1的表达水平；用罗丹明6G外排实验检测罗丹明6G在CDR1,CDR2基因表达差异的白念珠菌中的外转运情况；以抽提的白念珠菌基因组DNA为模板,对ERG11,TAC1,CAP1基因的编码序列进行PCR扩增,获得全长片段并测序,利用NCBIDatabase和Candida Genome Database提供的BlastN和BlastX方法进行比对,寻找是否存在有意义的突变。
本课题研究证实临床耐药菌株中耐药相关基因CDR1、CDR2、MDR1的高表达与其耐药性产生密切相关；转录因子TAC1高表达调控CDR1基因的高表达,是CDR1高表达引起菌株耐药性产生的重要原因。罗丹明6G外转运实验证明CDR1、CDR2基因的高表达引起药物外转运增加,是菌株耐药性产生的重要原因。ERG11变异的检测只发现有D116E,E266D两个位点的变异与耐药性产生密切相关,未检测到国内外其他文献中提及的其他变异。而对CAP1和TAC1的测序未发现与耐药性产生密切相关的变异位点,说明转录因子的变异可能不是耐药性产生的重要原因。
本课题研究的部分菌株中,确证其对氟康唑耐药,但是未发现已知耐药相关基因的高表达和变异,这充分佐证白念珠菌耐药性产生的多分子机制,耐药性产生是多步骤而又复杂的,是以一种机制为主,还是多种机制并存,目前尚不清楚。此外,本课题的实验菌株全部取自长海医院临床分离培养的菌库,对于了解我国地域性的耐药白念珠菌分子流行病学特点,具有研究意义,其中重要的耐药分子机制还有待我们进一步探讨。