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原发性肝癌属于高度恶性肿瘤,其组织类型以肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占绝大多数,被喻为我国癌症中的第二号杀手[1]。大多数情况下,HCC是在长期、慢性肝病的背景下发生的(约占总体HCC患者的70%～90%)[2]。在东南亚和非洲地区,HCC的主要致病因素为乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染及黄曲霉毒素B1的接触;而在欧洲、北美、日本等地区,丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染和酒精是最主要的因素[3]。从全球范围内来看,HBV感染是HCC最重要的危险因素,HCC患者中HBV感染率占50%以上[4]。由于我国HBV、HCV感染者众多,现有HBV患者约9300万人,约占全世界的1/4,因此全世界约55%肝癌病人主要集中在我国。我国肿瘤登记中心最新统计数据表明,HCC每年新发病例约36.6万,位居全国恶性肿瘤发病的第3位,发病率为19.44/10万;HCC每年死亡病例约32.1万,位居全国恶性肿瘤死亡的第2位,死亡率为16.84/10万[1]。由此可见,HCC严重威胁国人健康,并且造成巨大的经济和社会负担。目前,临床上HCC的主要治疗手段有手术切除、肝脏移植、放疗、化疗、栓塞、介入治疗和分子靶向治疗等[5,6]。尽管HCC治疗手段多,在疗效上也取得了很大的进步,但是治疗后极易复发与转移、远期存活率仍未得到明显提高。研究认为,癌基因、抑癌基因异常表达,癌信号通路调节失常导致癌细胞分子生物行为改变是造成HCC术后复发、转移的重要原因[7,8]。因此,揭示上述分子调控机制,探讨其在促进HCC发生发展的作用,对指导HCC的临床治疗具有重要意义。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长度约19～25个核苷酸的小分子非编码RNA,在细胞核和细胞质内由一系列RNase Ⅲ内切酶和转运蛋白等逐步加工完成[9]。在细胞核内,首先由RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ转录合成初级miRNA(Pri-miRNA),经过 Drosha 及 DGCR8 剪切形成 miRNA 前体(Pre-miRNA),然后在输出蛋白5(Exportin-5)和RAN复合物协助下转运出细胞核,随后在细胞质内,被Dicer/TRBP剪切成双链RNA。通常,上述双链RNA中的一条单链会与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)结合,另一条链发生降解;也有一些miRNA双链会打开并分别与不同的RISC结合。MiRNA具有高度保守性、序列同源性、时序及组织特异性,通过与靶mRNA 3’非翻译区域即3’-UTR(3’-untranslatedregion,3’-UTR)特异的碱基配对,对靶基因产生调控作用,参与胚胎发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤的发生发展。生物信息学研究发现,miRNA能够调控20%～30%的人类基因,与人类肿瘤、心血管疾病密切相关[10]。实验和临床研究表明,miRNA在肿瘤的异常表达,通过作用于原癌基因、抑癌基因、细胞周期蛋白、癌信号通路关键激酶、凋亡因子、转录因子、生长因子等来调控肿瘤的生物学行为,是影响其治疗效果和患者预后的重要因素[11,12]。近年来,随着新的miRNA分子的不断发现和研究的深入,一些miRNA在HCC的发生和侵袭转移的巨大潜力已经逐渐得到认识[13]。MiR-122是肝细胞表达丰度最高的miRNA,通过调节整合素-金属蛋白酶17(A disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)[14]和 miR-122/CUX1/RhoA 通路[15],影响 HCC侵袭转移的生物学行为。另一个肝细胞高丰度miR-199a/b-3p可抑制癌基因PAK4的表达,通过抑制PAK4/Raf/MEK/ERK通路的活化发挥抑癌作用,其在HCC组织表达减少与HCC患者不良预后密切相关。近5年来,我们研究团队一直关注miRNA在HCC发生发展过程中作用的研究,发现一些miRNA参与HCC分子生物行为的调控。MiR-34a通过调节p53信号通路和细胞周期影响HCC 生物行为[16]。MiR-145 靶向胰岛素受体底物 1(Insulin receptor substrate 1,IRS1),通过调控其下游Akt/FOXO1信号通路,抑制HCC细胞的生长[17]。目前,我们研究团队负责的研究项目《组蛋白乙酰化修饰诱导ncRNA异常表达在肝癌术后复发转移机制的研究》、《miR-106a通过调控TIMP-2对肝癌细胞凋亡机制的研究》和《c-MET调控Ras-Raf-Erk/Wnt信号通路影响肝癌生长及侵袭能力的机制研究》,仍在进行之中,部分研究通过液相芯片技术分析HCC癌组织miRNA表达谱的差异,发现了一些与调控HCC生长和侵袭能力密切相关的miRNA[16,17]。最近,我们检测结果显示miR-449a是在HCC癌组织呈现低表达的miRNA之一。为此,我们立足前期研究基础,采用荧光定量qRT-PCR技术检测miR-449a和c-Met在HCC患者癌组织和癌旁非癌组织的表达,设计细胞实验和动物实验,研究改变miR-449a表达水平对HCC细胞生长和侵袭能力影响,探讨miR-449a通过靶向c-Met基因与调节其下游信号通路,影响HCC细胞分子生物行为的机制。第一章HCC癌组织miR-449a和c-Met的表达目的:探讨HCC癌组织miR-449a异常表达与临床病理特征和预后的关系。方法:收集我院肝胆外科2014年5月至2016年4月期间,经手术切除38例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织标本,记录临床资料与建立随访档案。荧光定量qRT-PCR检测HCC癌组织和癌旁非癌组织的miR-449a和c-Met mRNA表达水平;根据miR-449a在HCC癌组织的表达水平,以均数为界值,将HCC患者分为miR-449a低表达组(n=28)和高表达组(n=10)。结果:HCC癌组织的miR-449a表达水平显著低于癌旁非癌组织,而癌组织的c-MetmRNA表达水平显著高于癌旁非癌组织,两者呈负相关。MiR-449a的表达水平与HCC的肿瘤直径、术后转移、复发密切相关,而与患者的性别、年龄、是否合并HBV、伴或不伴肝硬化、AFP水平、肿瘤数目、肿瘤有无包膜和病理分级等其它临床病理特征无明显相关。MiR-449a低表达组的总体生存时间和无瘤生存时间均明显小于高表达组。结论:HCC癌组织中miR-449a表达下降,与c-Met表达水平呈负相关,提示miR-449a有可能对c-Met具有负性调控作用。MiR-449a低表达有可能促进HCC的侵袭转移,进而影响HCC患者的预后。第二章改变miR-449a表达水平对HCC细胞生长和侵袭能力影响目的:进行体外细胞实验和体内成瘤实验,探讨改变miR-449a表达水平对HCC细胞生长和侵袭能力的影响。方法:分别检测miR-449a在肝细胞L02和4种HCC细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)的表达水平。采用脂质体转染技术,诱导Bel-7402细胞miR-449a高/低表达,成功制备miR-449a mimic细胞、mimic-NC细胞、miR-449a inhibitor细胞和inhibitor-NC细胞。CCK-8方法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力。皮下注射miR-449a mimic细胞(miR-449a组)和mimic-NC细胞(NC组)进行体内成瘤实验,注射细胞7d后,裸鼠皮下种植瘤显现,28d后切除种植瘤,测量瘤体的重量和体积。结果:MiR-449a在4种HCC细胞株的表达水平均显著低于L02细胞,其中Bel-7402表达miR-449a水平最低,因此选取Bel-7402作为进一步实验的细胞。MiR-449amimic细胞能够升高miR-449a表达,明显高于mimic-NC细胞;miR-449a inhibitor细胞能够降低miR-449a表达,显著低于inhibitor-NC细胞。MiR-449a mimic细胞在转染24h、48h、72h的增殖率均显著低于mimic-NC细胞相应时相的增殖率,而miR-449a inhibitor细胞在转染24h、48h、72h增殖率均明显高于inhibitor-NC细胞相应时相的增殖率。MiR-449amimic细胞处于G1期的比例明显高于mimic-NC细胞,而miR-449a inhibitor细胞处于G1期的比例明显小于inhibitor-NC细胞。MiR-449amimic细胞穿过Transwell小室的每高倍视野细胞数明显小于mimic-NC细胞,而miR-449a inhibitor细胞穿过Transwell小室的每高倍视野细胞数明显多于inhibitor-NC细胞。成瘤实验表明,高表达miR-449a组的瘤体重量和体积均显著小于NC组。结论:高表达miR-449a可以抑制Bel-7402细胞的增殖、阻滞细胞G1/S期的转换和减弱细胞的侵袭能力,低表达miR-449a可以促进细胞的增殖、细胞G1/S期的转换和增强细胞的侵袭能力。高表达miR-449a能够抑制细胞体内成瘤的能力。第三章miR-449a靶向c-Met调控HCC细胞生长和侵袭能力目的:探讨miR-449a靶向c-Met基因调控HCC细胞生长和侵袭能力的分子机制。方法:采用 Western blot 方法检测 Cdk2、Cdk4、Cdk6、CyclinD1、Cyclin E1、c-Met、pERK、Ras、Raf-1蛋白的表达。联合应用生物信息学软件和双荧光素酶报告基因检测技术来预测、验证miR-449a作用的靶点。运用siRNA干扰技术沉默c-Met表达,使用CCK-8方法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果:升高Bel-7402细胞miR-449a表达水平,能够抑制Cdk6、Cyclin D1、Ras、Raf-1和pERK蛋白的表达。C-Met是miR-449a直接作用的靶点。MiR-449a通过直接靶向c-Met基因3’-UTR来抑制c-Met的表达。通过抑制c-Met表达可以明显抑制Bel-7402细胞的增殖、阻滞细胞G1/S期的转换和减弱细胞的侵袭能力,该效应与高表达miR-449a导致Bel-7402细胞分子生物行为改变的结果相似。结论:高表达miR-449a不仅可以抑制Cdk6和Cyclin D1的表达,阻滞细胞周期的转换,而且还可以抑制Ras、Raf-1和pERK的表达,进而影响Ras/Raf/ERK信号通路的激活,减弱细胞的生长和侵袭能力。MiR-449a通过负性调节c-Met的表达来调控HCC细胞的分子生物行为。抑制c-Met表达可以抑制Cdk6、CyclinDl和pERK的表达,阻滞细胞周期的转换,调节Ras/Raf/ERK信号通路的激活,减弱细胞的生长和侵袭能力。