云南(会泽、兰坪)铅-锌矿区深色有隔内生真菌(DSE)的研究

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深色有隔内生菌(Darkseptateendophytes,DSE)是土壤生态系统中的一类广泛分布并具有重要的生态功能的微生物,在重金属污染土壤大量存在并在生态系统的植被恢复和土壤修复过程中发挥重要的作用。本研究在对云南会泽和兰坪两个样地铅-锌矿污染地区自然生长的植物根内DSE的定殖情况进行了全面调查的基础上,从中分离深色有隔内生真菌;并通过形态学比较和对核糖体小亚基ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列的分子分析,对这些菌株的系统发育地位进行了鉴定;对得到的几株DSE菌株进行纯培养,研究了其对碳、氮源的利用;利用合成培养基对其进行了重金属耐性和积累特征的研究,并对其耐受和富集重金属的机理进行了初步的探讨。以玉米为宿主植物,利用DSE菌株进行了回接试验,检测了DSE菌株在玉米根部的定殖情况。研究取得的主要结果和结论如下: 1.用碱解离、酸性品红染色法对兰坪和会泽两个样地中73种自然生长植物的188个根样的DSE定殖状况进行了调查,发现约97%的受调查的植物被DSE感染,且感染程度依植物类型不同而不同、同时与样地土壤重金属含量及形成年代等生态因子也有关系。 2.用PDA培养基从两地感染程度比较深的植物根内分离到四株不同的DSE菌株。根据形态学特征和ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列的分子分析,其中的一株H93被鉴定为嗜鱼外瓶霉(Exophialapisciphila),其它几株由于在现有的培养条件下不产孢子,因而尚缺乏最基本的形态学证据,仅根据其DNA序列比较暂将其归为子囊菌中的相关属、种。 3.对所有DSE菌株进行液体培养,发现其在以氨基酸为唯一N源的培养基上生长迅速,表明此类真菌可以利用土壤中大量存在而不能被植物直接利用的氨基酸。推测其在植物根内的定殖或许可以扩大植物利用营养物质的范围。 4.分别利用合成培养基和马铃薯蔗糖液、固体培养系统研究了各菌株对铅、锌、镉的耐性和积累能力,并对其耐性机理做了初步的探讨。发现所有DSE菌株在液体培养基中都可以耐受1g/L以上的pb2+;H93对锌和镉也具有极端的耐性,其MIC值分别为3g/L和0.5g/L。所有耐性菌株对所耐受的重金属都有超积累作用,H93可以在其菌丝体内积累其菌丝干重25%以上的铅,可以积累5%以上的镉,15%以上的锌,而且在此状态下可以缓慢生长。部分积累的重金属可以被CaCl2交换洗脱下来,形态学变化和酶活性变化也说明DSE对重金属的耐受性是多种途径综合效应的结果。 5.在含有基本营养成分和低浓度琼脂的培养基中接种玉米和DSE的菌块,建立起DSE和玉米之间初步的共生(广泛意义上)体系,经过3周的培养,可见DSE在玉米根内大量定殖,并形成大量的根外菌丝。说明DSE在植物根内外生长,可以具有相当的生物量,并可以形成类似于丛枝菌根真菌的发达的根外菌丝,从而或许可以增加植物根部的物质交换面积和吸收吸附及物质转运的速度和总量,扩大了植物根系的外延。同时可以构成一个屏障对不良因素起到过滤的作用。 本论文的创新性主要体现在两方面:一是对云南两个Pb-Zn矿矿区自然生长植物的DSE定殖情况进行了调查,发现大多数植物为DSE感染,而且矿区的优势植物通常形成深度感染,提示着DSE在这一特殊生态环境中可能具有重要的生态学功能;二是在离体条件下对重金属污染土壤来源的DSE的生物学特性、对重金属的积累和耐受性进行了初步的探讨,为DSE在这一区域的应用打下了一定的基础。
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