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自1983年首次获得转基因植株以来，转基因技术被广泛用于改良植物的遗传性状。为了把转基因细胞和非转基因细胞分离开来，在转基因过程中往往引入了选择标记基因。选择标记基因的引入，使得转基因材料具有抗某种抗生素或化学物质的能力，如含有nptⅡ基因的植株具有抗卡那霉素的特性。然而，利用选择标记基因至少存在4个方面的问题：1．对植物细胞的增殖和分化有不利的影响，2．对环境存在潜在危害，3．在食用上有一定的安全风险和消费心理障碍，4．不便于采用已成熟的条件进行重复转化。事实上，在获得转基因细胞或植株后，选择标记基因已不再需要，可以予以删除。目前删除选择标记基因的方法主要有共转化、转座子系统、同源重组和特异位点重组酶系统(R/RS、Cre/LoxP、FLP/FRT)等。其中，尤以特异位点重组酶系统研究的最为深入，但仍存在系统不稳定、删除困难或删除不完全等问题，有待进一步完善。
本研究利用严谨性热激启动子HSP70m控制Cre/LoxP删除系统、利用ipt基因促进转基因材料在不加细胞分裂素的培养基上进行不定芽分化、利用Kan抗性基因和ipt基因对转基因细胞进行双重选择以期减少假阳性，而在获得转基因试管苗后热激删除Kan和ipt选择标记等基因，使因枷基因表达所导致的畸形苗恢复正常生长，从而获得无选择标记基因的转基因植株。主要实验结果如下：
1、克隆了ipt和cre基因。
采用高保真的pfuDNA聚合酶和特异引物，分别从农杆菌菌株C58和大肠杆菌菌株BM25.8的基因组中扩增出ipt基因和cre基因，TA克隆后测序，结果与GenBank中公布的序列一致。
2、构建了具有Kan和ipt选择标记基因与Cre/LoxP热激删除系统的植物基因表达载体。
成功构建了pQSL05、pQSL15和pQSL16三个植物基因双元表达载体。其中，pQSL05中仅含有35S—ipt而无Kan抗性基因，用以分析单独的ipt基因作为选择标记基因时的筛选效果。pQSL15中含有Kan抗性基因和Cre/LoxP系统，用以建立Kan抗性基因的删除技术并分析删除效果。pQSL16中含有Kan抗性基因、野生型ipt基因和热激启动子控制Cre/LoxP删除系统，用以获得ipt促进转化子分化、进行Kan与ipt双重筛选、热激诱导删除等在烟草材料上使用的具体技术参数。
3、在烟草上成功验证了所构建的选择标记基因热激删除系统。
通过叶盘转化法转化烟草，分别得到三种不同表型的转基因植物。
(1)用pQSL05转化烟草，得到了经PCR扩增鉴定的转基因植株，而且在不加BA的培养基上，ipt基因即能促进大量不定芽产生，但由于ipt基因组成性过量表达，生成的不定芽均为畸形，并且很难生根；因此，组成性表达的ipt难以单独作为选择标记基因使用。
(2)用pQSL15转化烟草，得到的转基因植株根部在常温下可以在荧光显微镜下观察到有GFP绿色荧光，说明该载体的T-dNA已经成功整合到烟草的基因组中。经过热激处理后，烟草转基因植株在含有Kan的培养基上逐渐白化而死亡，而在不含Kan的培养基上生长正常且观察不到GFP绿色荧光。提取常温下的试管苗和热激后产生无绿色荧光的试管苗的总DNA，用特异引物扩增，在常温下的转基因试管苗的总DNA中可以得到gfp和nptⅡ基因的片段，而在热激后的试管苗的总DNA得不到以上的片段，表明由HSP70m控制的Cre/LoxP系统能通过热激有效删除了选择标记基因。
(3)用pQSL16转化烟草，得到了与转pQSL05相似畸形性状的转基因试管苗。通过热激处理，畸形转基因试管苗在含有Kan的培养基上慢慢地白化死去，而在不含Kan的培养基中渐渐恢复正常生长，且恢复了生根能力，在荧光显微镜下没有观察到GFP绿色荧光，而且经PCR分子鉴定结果表明，通过热激删除得到了无选择标记基因的转基因植株。