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自二十世纪五十年代以来，有机磷化合物已被广泛地用于农用杀虫剂。由于有机磷化合物能不可逆抑制动物神经系统中的乙酰胆碱酯酶，破坏神经传递，因此对人及家畜等脊椎动物具有极强的毒副作用。由于杀虫剂的过量和连续使用，许多地区土地、水生态系统被有机磷化合物污染，对人类健康构成巨大威胁。目前去除有机磷污染物的方法(漂白处理、碱水解、焚烧或填埋处理等)反应条件剧烈、副产物具有毒性及腐蚀性，限制了广泛应用。微生物来源的磷酸三酯酶(PTE, EC3.1.8.1)可以广泛水解有机磷杀虫剂，具有环保和原位解毒优势，提供了生物修复新途径。由于磷酸三酯酶均来源于常温微生物，较低的生物学稳定性限制了其实际应用。因此，应用生物技术手段，研发生物学稳定性好、广谱、高效的有机磷杀虫剂降解酶势在必行。通过检索细菌基因组数据库，我们发现嗜热细菌Geobacillus kaustophilus HTA426基因组DNA中含有一个磷酸三酯酶(命名为GkaP)编码序列GK1506(GenBank ID:3183579)，我们对该基因进行了异源表达，并对重组蛋白的酶学性质、催化机制及分子进化等方面开展了系统研究。重组GkaP具有优异的生物稳定性，它能够有效的水解各种内酯，以及“非专一性”的磷酸三酯酶活力及酯酶活力。因此GkaP应该被归类到近年来新命名的类磷酸三酯酶的内酯酶(posphotriesterase-like lactonase, PLL)家族。酶的催化“非专一性”是趋异进化成新功能的一个显著特征，研究酶的“非专一性”有助于我们理解蛋白的进化及其祖先，因此GkaP成为了研究磷酸三酯酶趋异进化的理想模式酶。为了探索GkaP独特的“非专一性”催化机制，我们对其金属中心附近热点(hot-spot)氨基酸的功能进行了研究，发现Tyr99位点可能与磷酸三酯酶的趋异进化密切相关。其中一个突变体Y99L对乙基对氧磷的催化效率(kcat/Km)提高11倍，但对δ-癸内酯的催化效率降低15倍，使得底物选择性产生了157倍的转化。对Y99L晶体结构分析表明，突变导致了相邻的loop7发生了大约6.6的向外偏移，这种精细的构象变化可能增加了活性中心的柔性，有利于对磷酸三酯底物识别和催化。我们还选择了假定的质子穿梭路径相关的残基(R230和G209)进行了研究。动力学数据表明突变体G209D的磷酸三酯酶和内酯酶活性分别提高了10倍和3倍，该突变体的晶体结构显示一个水分子与R230和D209分别形成了氢键，这导致R230的侧链构象发生偏转最终使得loop7区域背离活性中心发生大约2的移动。我们推测底物结合loop (loop7)的向外偏移可能创造了更大的底物结合空间，使得更有利于酶对不同底物的催化。我们的工作表明通过少数氨基酸取代可能影响底物结合loop区的动态和构象分布，从而改变“非专一性”酶对底物识别和催化的能力。这些结果对于理解“非专一性”酶的催化机制提供了新的线索。蛋白质工程技术是提高酶的催化效率、改变底物选择性的有效方法。我们以GkaP为模板进化其潜在的有机磷水解能力。结合理性设计和随机突变的策略，经过四轮的突变和筛选(大约10,000个克隆)，获得了若干磷酸三酯酶活力显著提高的突变体。其中最优的突变体26A8C对于有机磷杀虫剂乙基对氧磷(ethyl-paraoxon)的催化效率相比野生型提高了232倍。除此，该突变体对于其它有机磷杀虫剂例如对硫磷(parathion)、地亚农(diazinon)和氯螨硫磷(chlorpyrifos)的活力提高了19-497倍，极大地拓宽了对有机磷杀虫剂的选择性。同时该突变体的内酯酶活力具有766倍的减少，使得GkaP由一个“非专一性”内酯酶转变成了“专一性”的有机磷水解酶。突变体26A8C含有8个氨基酸的取代：F28I、Y99L、T171S、F228L、N269S、V270G、W271C、G273D。通过结构分析发现大部分突变位点(F228L、N269S、V270G、W271C和G273D)均位于底物结合loop7和8上，进一步证明这两段表面loop在磷酸三酯酶乃至整个酰胺水解酶超家族对底物选择性具有重要作用。我们的工作不但有利于揭示磷酸三酯酶的趋异进化机制而且表明GkaP具有极大的进化潜力，它可以通过实验室进化手段创造高效的催化剂从而为有机磷毒物的降解提供潜在的解决方案。