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慢性阻塞性肺病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）,是一种常见的、可以预防和治疗的疾病,其特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限,原因是气道和/肺泡异常、通常与显著暴露于毒性颗粒和气体相关。吸烟被认为是COPD的首要发病因素,吸烟人群患COPD的概率远高于非吸烟者。吸烟可以引起氧化应激反应、诱发炎症和免疫系统调节异常,激活呼吸道上皮细胞和巨噬细胞,从而引起了炎症介质的大量释放,这最终导致了呼吸道炎症、气流受限以及肺实质的损伤和肺气肿的形成。迄今为止,糖皮质激素类药物是治疗COPD的首选药物,以干粉吸入剂为主,其与支气管扩张剂的联用是常见的治疗策略。这些药物均给COPD患者带来了福音,然而,该类药物同时具有诸多副作用,如加重肺部感染风险、造成口腔真菌感染以及声音嘶哑等。而全身应用糖皮质激素时,还会引发免疫系统的损伤、诱发感染、糖皮质激素抵抗以及骨质疏松等。此外,有相当一部分COPD患者对糖皮质激素不敏感。因此,开发安全、有效、质量可控的治疗COPD的新药仍然极为迫切。本论文所研究的二烯丙基二硫醚和左旋薄荷醇复方制剂组分均来源于天然产物。二烯丙基二硫醚（DADS）是大蒜中含量较高的挥发性有机硫化物,流行病学、临床、生物和动物实验结果表明,大蒜中的有效成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗高血压、保护心脏和抗癌等多种药理活性。在本课题组的前期工作中,DADS被确定为是治疗COPD的大蒜吸入疗法的有效成分之一和成药性最高的成分。药理学实验结果表明,DADS对肺炎、肺癌等呼吸系统疾病均具有良好的治疗潜力。左旋薄荷醇（L-menthol）是一种萜类化合物,药理学研究表明,其具有抗炎、抗氧化、抗菌、清凉、镇痛等多种生物活性。此外,L-menthol也是多种复方制剂的主要活性成分,在许多呼吸系统疾病,如支气管炎、过敏性鼻炎、喉炎和鼻窦炎等的临床治疗中取得了较好的效果。结合本课题组的前期工作,L-menthol还可以有效的掩盖DADS的刺激性气味,并改善DADS引起的溶血反应。本论文研究分为以下四个部分:（1）抗COPD的体外药理活性研究,（2）治疗COPD的体内药理活性及分子生物学作用机制考察,（3）药代动力学特征,（4）药物相互作用评价。1.抗COPD的体外药理活性研究:体外研究采用小鼠巨噬细胞Raw264.7和人肺成纤维细胞HFL-1建立了两种细胞模型。通过在Raw264.7细胞培养液中添加脂多糖（LPS）建立了基于LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型,实验结果表明,DADS及L-menthol可以减少巨噬细胞由LPS刺激所分泌的NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放,并呈现剂量依赖性。中性红吞噬实验结果显示,DADS和L-menthol还可以减弱巨噬细胞的吞噬作用,从而减弱炎症反应。通过在HFL-1细胞培养液中添加香烟烟雾提取物（CSE）建立了 HFL-1细胞模型,弹性蛋白酶测定结果表明,DADS和L-menthol可以减少HFL-1细胞分泌的MMP-9和TIMP-1的量,从而对弹性蛋白酶失衡进行调控。2.注射和吸入给药抗COPD的体内药理活性研究:采用给大鼠腹腔注射香烟烟雾提取物（CSE）的方法建立了体内COPD模型。腹腔注射给药的体内研究内容包括评价复方药物针对肺灌洗液、肺匀浆、肺组织中炎症应激和氧化应激的调控效果。采用腹腔注射的给药方式,以布地奈德为阳性对照药物,分别考察了单独给予DADS、L-menthol、DADS 与 L-menthol 二者联用、DADS 与 L-menthol 和布地奈德三者联用的治疗效果。肺灌洗液炎症细胞计数实验结果表明,DADS和L-menthol可以降低肺灌洗液中的炎症细胞总数,尤其是巨噬细胞的数量。ELISA实验结果显示,肺匀浆中的炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的水平治疗后均明显下降。氧化应激标志物的测定结果指出,DADS和L-menthol可以显著降低氧化物的含量,并提高抗氧化剂的水平和机体的总抗氧化能力。以上肺灌洗液和匀浆的实验结果在肺组织形态学和免疫组化研究中得到了进一步证实。DADS和L-menthol治疗后,肺组织形态学变化显著,肺气肿特征明显改善,肺泡间隔显著缩小,肺泡破坏指数降低。免疫组化实验结果表明,DADS与L-menthol可以显著地降低肺组织中MMP-1和TIMP-1的表达,从而证实了二者具有调控COPD的弹性蛋白酶-抗弹性蛋白酶失衡的作用。DADS与L-menthol发挥抗COPD活性的分子生物学机制研究显示,复方药物主要是通过抑制NF-κB和激活Nrf2信号通路而发挥作用。在各种机制的研究中,L-menthol的作用强度弱于DADS,属于非拮抗的关系。与阳性药布地奈德相比较,DADS与L-menthol组避免了布地奈德全身用药所引起的体重降低等副作用。另外,DADS和L-menthol对于COPD大鼠肺组织形态改善作用较为明显,且肺气肿病理特征的改善作用显著优于布地奈德。吸入给药的体内研究主要评价了复方药物针对肺灌洗液中弹性蛋白酶与抗弹性蛋白酶、肺组织形态和肝功能的影响。选用DADS与L-menthol的高、中、低剂量组以及二者与布地奈德联用的高、中、低剂量组进行了对比研究。ELISA法测定肺灌洗液上清中的MMP-9和TIMP-1含量,实验结果表明,给药后二者的含量以及含量比值均显著下降,这说明吸入给药后,肺实质的损伤减少,从而使肺气肿得到了明显改善。组织形态学研究结果显示吸入给药后,给药组的肺泡间隔显著缩小,与腹腔注射给药相比较,具有明显的差异。ALT和AST测定结果表明DADS和L-menthol给药后二者明显降低,证明COPD引起的肝功能损伤得到缓解,低、中、高剂量组治疗效果依次增强。3.药代动力学研究:为了给后期合理用药、剂型设计等工作提供理论依据,DADS和L-menthol药代动力学研究包括静脉注射、口服、吸入等不同给药途径下的药代动力学参数的测定。在大鼠中分别研究了 DADS经静脉注射、口服、吸入给药后的药代动力学,并对其生物利用度进行了计算。DADS体内主要的代谢产物鉴定为甲基烯丙基亚砜（AMSO）和甲基烯丙基砜（AMS02）。药代动力学实验结果表明,与口服给药相比,DADS吸入给药后,AMSO的达峰时间明显缩短,由6h缩短至2 h。以AMSO和AMS02来计算的口服平均生物利用度分别为29.32%和46.14%;AMSO和AMSO2的吸入平均生物利用度分别为15.31%和14.21%。以L-menthol的原型药物来考察其静脉注射和吸入的药代动力学特征,计算所得其吸入生物利用度为50.24%。4.药物相互作用研究:药物相互作用是新药在开发阶段必须进行的重要研究工作。采用体外人肝微粒体孵育模型,以非那西汀、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗以及睾酮分别作为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针底物,进行了 DADS及其体内代谢产物AM,AMS、AMSO和AMS02以及左旋薄荷醇（L-menthol）对人肝微粒体CYP450代谢酶的抑制作用,推断其可能发生的药物相互作用,为进一步临床合理用药提供指导。实验结果表明,DADS及其代谢产物AM、AMS、AMSO、AMS02均为CYP2E1的中等强度抑制剂,且四种代谢物的抑制强度高于DADS,L-menthol是CYP2D6和CYP1A2的中等强度抑制剂,此外,DADS和L-menthol对最常见的药物代谢酶CYP3A4和CYP2C没有显著的抑制作用。综上所述,本论文针对DADS和L-menthol复方药物在抗COPD的体外药理活性、体内药理活性、分子生物学作用机制、药代动力学特征、药物相互作用等方面开展了初步成药性评价。研究结果表明,DADS和L-menthol是极具开发潜力的、低毒、多靶点的抗COPD药物,针对COPD的四大主要发病机制（炎症、氧化应激反应、弹性蛋白酶失衡和免疫失衡）均有显著的调控作用,成药性较高。首先,复方药物具有较好的抗炎效果,表现为其可以显著减少大鼠体内白细胞总数尤其是巨噬细胞数量、明显降低大鼠体内炎症因子的释放,其作用机制为抑制NF-κB信号通路。其次,复方药物在调控氧化还原失衡方面也表现出了显著效果。氧化应激标志物的测定结果显示,复方药物可以显著降低氧化物的含量,并提高抗氧化物的水平和机体的总抗氧化能力,其作用机制为激活Nrf2信号通路。再次,复方药物改善肺组织形态的作用显著优于阳性药物布地奈德,作用机制是复方药物可以有效调控弹性蛋白酶失衡-抗弹性蛋白酶失衡。此外,复方药物还可以调控免疫细胞在体内的失衡,表现为显著减少CD4+和CD8+T细胞在肺部的募集。复方药物吸入给药与腹腔注射给药的对比研究显示,吸入给药后COPD的大鼠的肺组织形态更趋近于正常大鼠,治疗效果明显优于腹腔注射给药。生物转化和药代动力学研究表明,DADS在体内主要代谢物AMSO和AMSO2,吸入给药后,AMSO的达峰时间由6h缩短至2 h。以AMSO和AMSO2来计算的口服平均生物利用度分别为29.32%和46.14%;吸入平均生物利用度分别为15.31%和14.21%。L-menthol的吸入生物利用度为50.24%。药物相互作用研究结果表明,DADS及其代谢产物AM、AMS、AMSO、AMSO2均为CYP2E1的中等强度抑制剂,且四种代谢物的抑制强度高于DADS,L-menthol是CYP2D6和CYP1A2的中等强度抑制剂,此外,DADS和L-menthol对最常见的药物代谢酶CYP3A4没有明显的抑制作用。