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目的;弱视是眼科临床常见的儿童眼病，是婴幼儿时期，由于各种原因如知觉、运动、传导及视中枢等原因未能接受适宜的视剌激，使视觉发育受到影响而发生的视觉功能减退的状态，主要表现为视力低下及双眼单视功能障碍。近年来，左旋多巴(L-dopa)作为治疗弱视的药物，在国内外的文献报道其疗效己获得了一定的认可。但L-dopa在人体内代谢的过程中存在外周副作用较大、药效波动范围较大、耐受性差等缺点。鉴于前期实验的基础，本实验组将左旋多巴通过结构改造，改造成其衍生物左旋多巴甲酶(LDME)。本研究的目的是通过给予不同剂量的左旋多巳甲酶，观察其对剥夺性弱视猫模型的影响，对左旋多巳甲酶的作用机制进行探讨，并评价其治疗弱视的药效学作用。
方法:初生家养幼猫(2-4周龄)30只随机分为6组(每组5只):左旋多巴甲醋高剂量组(LDMEH )、中剂量组(LDMEM )、低剂量组(LDMEL )、阳性药左旋多巳对照组、正常对照组(NC)、弱视模型对照组(AC)。除了正常组外，于4周龄时参照Hubel经典实验方法对各组幼猫进行麻醉后的左眼单纯上下险缝合建立剥夺性弱视。12周龄经图形视觉诱发电位(P-VEP)确定形成弱视后，灌胃给与左旋多巴甲酶20，40,80mg·kg-1，阳性对照组给与左旋多巴40mg·kg-1，正常对照组及模型组均给与等量生理盐水。每天一次持续30天。
1、应用图形视觉诱发电位(P-VEP)研究左旋多巳甲醋对各组猫视皮质电生理的影响;2、进行E染色和透射电镜观察左旋多巳甲酶给药组猫外侧膝状体形态学的变化;3、TUNEL检测法观察外侧膝状体神经细胞的凋亡情况;4、免疫组织化学法检测外侧膝状体中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达;5、Westem-blot法检测视外侧膝状体中NGF、c-Fos蛋白的表达。6、相对定量荧光PCR(Real time-PCR)法检测外侧膝状体中c-fosmRNA的表达。
结果:
1、剥夺性弱视的视觉电生理研究
与正常对照组同侧猫眼相比，剥夺性弱视模型组中剥夺眼的P-VEP波幅值明显降低及P1OO值潜时延长，差异具有统计学意义(P＜O.O1)。与剥夺性弱视模型组相比，各药物治疗组中剥夺眼的P-VEP振幅有不同程度的升高且P100值潜时减少，其中左旋多巴甲醋高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P＜O.05)。提示左旋多巴甲醋高剂量组通过提高P-VEP振幅和减少P100值潜时，使剥夺性弱视猫弱视眼的信号传导功能得到改善。
2、外侧膝状体的形态学研究
模型组外侧膝状体的核浆比例降低和核移位，有些神经元肿胀或变形，同时有胶质细胞增生。大量细胞变性死亡;细胞核核膜模糊，核内染色体边集:粗面内质网扩张，线粒体数量减少，峭不清晰。而经左旋多巴和左旋多巳甲酶治疗后，各组外侧膝状体神经细胞变性死亡数目减少，神经细胞数量增多，少见神经元变形或肿胀现象，胶质细胞少量出现，核膜较模型组清晰，线粒体数目增加，崎清晰，粗面内质网扩张情况得到缓解。
3、左旋多巴甲酶对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的影响
与剥夺性弱视模型组相比，左旋多巴对照组、左旋多巴甲酶高、中、低剂量组外侧膝状体中各层的内源性nNOS免疫阳性细胞数量均有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。与左旋多巴阳性组相比，高剂量组中的内源性nNOS阳性细胞数多于左旋多巴阳性组，低于正常对照组，但两组未见有统计学差异(P＞0.05)。
4、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体细胞凋亡表达的影响
TUNEL染色细胞计数时发现，在外侧膝状体中的TUNEL阳性细胞在相同时期内表现出不同剂量下的左旋多巴甲醋治疗效果。模型对照组中外侧膝状体细胞凋亡结果显示与正常对照组(很少的细胞凋亡)比较神经细胞内发生了严重的DNA断裂情况。治疗后，给药各组的凋亡细胞数量与模型对照组比较均有不同程度的减少。而左旋多巴甲醋高剂量组的逆转细胞凋亡水平的作用最为明显(P＜0.05)。正常组和模型对照组左侧外膝体细胞凋亡水平分别为6.08％和37.25％(A层)，两数值间的差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗30天后，左旋多巴甲醋对左侧外侧膝状神经细胞发挥了一定的治疗作用(P＜0.05)。
5、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体神经生长因子(NGF)的影响
Westemblot分析显示，剥夺性弱视模型组外侧膝状体中的NGF蛋白的表达明显少于正常组(P＜0.05)。与剥夺性弱视模型组相比，左旋多巴组与左旋多巴甲酶低、中、高给药治疗组外侧膝状体中NGF蛋白的表达有所增加，其中左旋多巴甲酶高剂量NGF蛋白表达水平最高(P＜0.05)。
6、左旋多巴甲酶对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体中c-fos基因的影响
Westemblot分析显示，剥夺性弱视模型组外侧膝状体中的c-fos蛋白的表达明显少于正常组(P＜0.05)。与剥夺性弱视模型组相比，各给药治疗组中的c-fos蛋白的表达逐渐增加。
7、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体c-fosmRNA表达的影响
RT-PCR结果显示，与正常对照组相比较，剥夺性弱视模型组外侧膝状体c-fosmRNA表达水平明显下调，差异有显著性(P＜0.05)。与弱视模型组相比，各给药治疗组外侧膝状体c-fosmRNA表达水平有所上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，而其中左旋多巴甲酶高剂量组表达最为明显(P＜0.05)。
结论:
1、左旋多巴甲酶能通过提高剥夺性弱视猫的P100波幅值减少P100波峰潜时和提升P100波幅值，使剥夺性弱视猫的视通路的信号传导得到改善，从而恢复视觉功能。
2、给予左旋多巴甲醋进行治疗后，剥夺弱视猫的外侧膝状体中的神经元修复能力和再生能力有所提高，神经细胞变性死亡数目减少，神经细胞数量增多，少见神经元变形或肿胀现象，胶质细胞少量出现，核膜较模型组清晰，线粒体数目增加，崎清晰，粗面内质网扩张情况得到缓解。
3、左旋多巴甲酶对弱视猫外侧膝状体的神经细胞有效地进行抑制凋亡进程。
4、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达水平上调。
5、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体经细胞NGF的蛋白表达水平提高，这与改善P-VEP中各波值的效果是一致的。
6、左旋多巴甲酶可明显增加剥夺性弱视猫外侧膝状体c-Fos蛋白的表达。
7、左旋多巴甲醋可使剥夺性弱视猫外侧膝状体c-fosmRNA水平的上调。
8、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体的功能得到恢复，可作为治疗弱视的潜在药物。其治疗的机制可能与其能调控外侧膝状体NGF、nNOS、c-fos的表达、提高神经元的修复和再生能力、抑制细胞凋亡的有关。
方法:初生家养幼猫(2-4周龄)30只随机分为6组(每组5只):左旋多巴甲醋高剂量组(LDMEH )、中剂量组(LDMEM )、低剂量组(LDMEL )、阳性药左旋多巳对照组、正常对照组(NC)、弱视模型对照组(AC)。除了正常组外，于4周龄时参照Hubel经典实验方法对各组幼猫进行麻醉后的左眼单纯上下险缝合建立剥夺性弱视。12周龄经图形视觉诱发电位(P-VEP)确定形成弱视后，灌胃给与左旋多巴甲酶20，40,80mg·kg-1，阳性对照组给与左旋多巴40mg·kg-1，正常对照组及模型组均给与等量生理盐水。每天一次持续30天。
1、应用图形视觉诱发电位(P-VEP)研究左旋多巳甲醋对各组猫视皮质电生理的影响;2、进行E染色和透射电镜观察左旋多巳甲酶给药组猫外侧膝状体形态学的变化;3、TUNEL检测法观察外侧膝状体神经细胞的凋亡情况;4、免疫组织化学法检测外侧膝状体中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达;5、Westem-blot法检测视外侧膝状体中NGF、c-Fos蛋白的表达。6、相对定量荧光PCR(Real time-PCR)法检测外侧膝状体中c-fosmRNA的表达。
结果:
1、剥夺性弱视的视觉电生理研究
与正常对照组同侧猫眼相比，剥夺性弱视模型组中剥夺眼的P-VEP波幅值明显降低及P1OO值潜时延长，差异具有统计学意义(P＜O.O1)。与剥夺性弱视模型组相比，各药物治疗组中剥夺眼的P-VEP振幅有不同程度的升高且P100值潜时减少，其中左旋多巴甲醋高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P＜O.05)。提示左旋多巴甲醋高剂量组通过提高P-VEP振幅和减少P100值潜时，使剥夺性弱视猫弱视眼的信号传导功能得到改善。
2、外侧膝状体的形态学研究
模型组外侧膝状体的核浆比例降低和核移位，有些神经元肿胀或变形，同时有胶质细胞增生。大量细胞变性死亡;细胞核核膜模糊，核内染色体边集:粗面内质网扩张，线粒体数量减少，峭不清晰。而经左旋多巴和左旋多巳甲酶治疗后，各组外侧膝状体神经细胞变性死亡数目减少，神经细胞数量增多，少见神经元变形或肿胀现象，胶质细胞少量出现，核膜较模型组清晰，线粒体数目增加，崎清晰，粗面内质网扩张情况得到缓解。
3、左旋多巴甲酶对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的影响
与剥夺性弱视模型组相比，左旋多巴对照组、左旋多巴甲酶高、中、低剂量组外侧膝状体中各层的内源性nNOS免疫阳性细胞数量均有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。与左旋多巴阳性组相比，高剂量组中的内源性nNOS阳性细胞数多于左旋多巴阳性组，低于正常对照组，但两组未见有统计学差异(P＞0.05)。
4、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体细胞凋亡表达的影响
TUNEL染色细胞计数时发现，在外侧膝状体中的TUNEL阳性细胞在相同时期内表现出不同剂量下的左旋多巴甲醋治疗效果。模型对照组中外侧膝状体细胞凋亡结果显示与正常对照组(很少的细胞凋亡)比较神经细胞内发生了严重的DNA断裂情况。治疗后，给药各组的凋亡细胞数量与模型对照组比较均有不同程度的减少。而左旋多巴甲醋高剂量组的逆转细胞凋亡水平的作用最为明显(P＜0.05)。正常组和模型对照组左侧外膝体细胞凋亡水平分别为6.08％和37.25％(A层)，两数值间的差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗30天后，左旋多巴甲醋对左侧外侧膝状神经细胞发挥了一定的治疗作用(P＜0.05)。
5、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体神经生长因子(NGF)的影响
Westemblot分析显示，剥夺性弱视模型组外侧膝状体中的NGF蛋白的表达明显少于正常组(P＜0.05)。与剥夺性弱视模型组相比，左旋多巴组与左旋多巴甲酶低、中、高给药治疗组外侧膝状体中NGF蛋白的表达有所增加，其中左旋多巴甲酶高剂量NGF蛋白表达水平最高(P＜0.05)。
6、左旋多巴甲酶对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体中c-fos基因的影响
Westemblot分析显示，剥夺性弱视模型组外侧膝状体中的c-fos蛋白的表达明显少于正常组(P＜0.05)。与剥夺性弱视模型组相比，各给药治疗组中的c-fos蛋白的表达逐渐增加。
7、左旋多巴甲醋对剥夺性弱视猫模型外侧膝状体c-fosmRNA表达的影响
RT-PCR结果显示，与正常对照组相比较，剥夺性弱视模型组外侧膝状体c-fosmRNA表达水平明显下调，差异有显著性(P＜0.05)。与弱视模型组相比，各给药治疗组外侧膝状体c-fosmRNA表达水平有所上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，而其中左旋多巴甲酶高剂量组表达最为明显(P＜0.05)。
结论:
1、左旋多巴甲酶能通过提高剥夺性弱视猫的P100波幅值减少P100波峰潜时和提升P100波幅值，使剥夺性弱视猫的视通路的信号传导得到改善，从而恢复视觉功能。
2、给予左旋多巴甲醋进行治疗后，剥夺弱视猫的外侧膝状体中的神经元修复能力和再生能力有所提高，神经细胞变性死亡数目减少，神经细胞数量增多，少见神经元变形或肿胀现象，胶质细胞少量出现，核膜较模型组清晰，线粒体数目增加，崎清晰，粗面内质网扩张情况得到缓解。
3、左旋多巴甲酶对弱视猫外侧膝状体的神经细胞有效地进行抑制凋亡进程。
4、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达水平上调。
5、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体经细胞NGF的蛋白表达水平提高，这与改善P-VEP中各波值的效果是一致的。
6、左旋多巴甲酶可明显增加剥夺性弱视猫外侧膝状体c-Fos蛋白的表达。
7、左旋多巴甲醋可使剥夺性弱视猫外侧膝状体c-fosmRNA水平的上调。
8、左旋多巴甲酶可使剥夺性弱视猫外侧膝状体的功能得到恢复，可作为治疗弱视的潜在药物。其治疗的机制可能与其能调控外侧膝状体NGF、nNOS、c-fos的表达、提高神经元的修复和再生能力、抑制细胞凋亡的有关。