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肺间质纤维化(Pulmonary fibrosis)是一种慢性疾病,病程逐渐发展、不可逆转,是间质性肺疾病的终末期,据统计其平均生存期短,不足5年。肺间质纤维化的患者呼吸困难明显,生活难以自理,且花费大,给社会、家庭、及个人带来沉重的精神及经济负担。因此延缓肺间质纤维化进展、降低死亡率是我国肺病防治所面临的巨大挑战和重大需求。虽然导致肺间质纤维化的病因不甚清楚,但肺间质纤维化的病理表现与信号通路主要表现为:肺间质中大量炎症细胞浸润,肌成纤维细胞显著增多从而产生过多的细胞外基质积聚,最终出现纤维化的病理改变。目前尚无有效手段阻止其进展。因此,阐明肺间质纤维化发生、发展机制,寻找有效的新的干预治疗策略,对阻止疾病发展、降低死亡率有着重大的意义。但是,目前我们尚不十分明确有关肺间纤维化这一疾病的发病机制。肺间质纤维化疾病病程中关键的病理改变包括肌成纤维细胞大量、异常增多。目前针对肌成纤维细胞的来源的研究较多,说法不一,争议较大。其研究结果显示多数观点倾向主要来源为肺泡上皮细胞,即EMT(epithelial to mesenchymaltransition)。肺泡上皮细胞活化后的一个重要效应是:转化为肌成纤维细胞,促进细胞外基质合成,同时活化多种参与固有免疫、炎症的基因等,促进炎症、氧化应激损伤,从而加重肺间质纤维化进展。由此推测:肺泡上皮细胞转分化(EMT)是肺间质中肌成纤维细胞的主要来源。深入研究EMT的机制及其活化后导致的重要分子生物学效应,是寻求干预靶点的重要防治策略。综上所述,肺间质纤维化是一种难治、复杂的疾病。目前传统激素及单通路受体阻滞剂(如吉非替尼)可能获得部分疗效,但不能阻止肺间质纤维化的进展。近年来有关我国中草药方剂及其单体活性成分在疾病治疗中的研究越来越多,其在肺间质纤维化的治疗中的作用也越来越引起大家的重视。本课题组前期实验证实活血化瘀方剂(黄芪、川芎、丹参、当归、红景天、浙贝母、甘草)对肺间质纤维化有治疗作用。其中甘草酸(Glycyrrhizic acid,GA)作为甘草中最主要的活性成分,大量研究表明甘草酸对脏器纤维化(如肝脏)有显著的治疗作用。但甘草酸对肺间质纤维化是否有改善作用我们尚不清楚。因此我们提出以下科学问题:多种炎症、多条信号通路的过度激活是肺间质纤维化的重要基础,EMT又是导致肺间质纤维化的重要途径,是什么调控了这些炎症因子和信号通路活性?甘草酸是否能够找到控制它们活性的共同靶点?近年,糖蛋白组学的飞速发展为我们解答以上问题提供了新的研究方向。核心岩藻糖基化(core fucosylation,CF)是一种重要的蛋白质糖修饰,是由α-1,6岩藻糖转移酶(Fucosyltransferase8,FUT8)特异性地催化转移岩藻糖,将其连接在靶蛋白的特定氨基酸位点的核心糖链上,从而完成靶蛋白质的折叠、空间构象。我们课题组研究表明脏器纤维化中其关键蛋白均为糖蛋白,所以,我们思考:甘草酸是否通过CF修饰调控这些炎症因子及信号通路的活性?要解决上述科学问题,本实验拟通过建立博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导肺间质纤维化大鼠模型明确甘草酸对肺间质纤维化有无作用;在大鼠肺间质纤维化模型上观察甘草酸对EMT的影响;在此基础上,通过观察甘草酸对CF的影响进而深入解析甘草酸抑制EMT的具体机制。本实验首次发现甘草酸能减轻BLM诱导的肺间质纤维化及抑制EMT;其次从糖生物学全新的角度阐释了甘草酸治疗肺间质纤维化的机制,填补了糖生物学在肺间质纤维化领域的空白,为临床研发新药提供了全新思路。第一部分甘草酸减轻BLM致肺间质纤维化目的:探讨甘草酸对BLM致大鼠肺间质纤维化的病理影响,明确甘草酸对肺间质纤维化有无干预作用。方法:利用BLM致大鼠肺间质纤维化模型,成功获得肺脏大体标本,使用不同剂量甘草酸观察其对肺脏病理的影响及明确对肺间质纤维化是否有治疗作用。首先大体观察甘草酸湿/干重比的影响;使用HE、Masson染色方法观测甘草酸对肺脏病理的影响;利用免疫组化及免疫印迹技术检测胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的变化;其次利用ELISA法检测大鼠的肺组织中Hyp含量,明确甘草酸对肺间质纤维化是否有干预作用。结果:与正常组相比,BLM诱导的大鼠肺间质纤维化中肺湿/干重比明显升高;HE、Masson染色显示肺脏病理明显加重;免疫组化及免疫印迹显示胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达明显增加;ELISA检测Hyp的含量明显升高。经甘草酸治疗后,肺湿/干重比明显降低;,肺脏病理明显减轻,胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ及Hyp表达较纤维化组明显降低,并随甘草酸剂量的升高而明显减轻,其中高剂量甘草酸具有显著的抑制作用。结论:在BLM致大鼠肺间质纤维化的模型中,甘草酸对抑制及保护肺间质纤维化起到了一定作用,并呈剂量依赖性。第二部分甘草酸对EMT的影响目的:阐述甘草酸对肺上皮细胞转分化的影响,明确甘草酸阻抑EMT。方法:在用博来霉素制备的大鼠肺间质纤维化模型中,使用特有标记物E-cadherin定位肺泡上皮,观察不同剂量甘草酸在肺泡上皮细胞转分化成肌成纤维细胞中的影响,明确甘草酸阻抑EMT进而减轻肺间质纤维化。免疫荧光共染方法检测不同剂量甘草酸对各组肺组织中E-cadherin、α-SMA的表达变化,免疫印迹方法对各组肺标本中上述蛋白采用定量分析,明确不同剂量甘草酸对上皮细胞转分化现象的影响;免疫荧光检测各组大鼠肺组织中p-Smad2/3、β-catenin的表达变化,利用免疫印迹方法对上述蛋白进行定量分析,明确不同剂量甘草酸对肺脏纤维化关键蛋白的影响。结果:免疫荧光及免疫印迹结果显示正常肺组织E-cadherin中等量表达,α-SMA低量表达。与正常组相比较,BLM致大鼠肺间质纤维化模型中α-SMA表达显著升高,E-cadherin表达显著下降;经甘草酸治疗后,免疫荧光及免疫印迹显示上述两种蛋白呈逆向变化,对EMT现象有明显抑制作用。免疫荧光及免疫印迹结果显示正常肺组织中p-Smad2/3、β-catenin低量表达。与正常组相比,BLM诱导大鼠肺间质纤维化模型中p-Smad2/3、β-catenin蛋白的表达显著升高;经甘草酸治疗后,免疫荧光及免疫印迹显示甘草酸明显抑制上述两种蛋白的表达。上述指标均显示与甘草酸的剂量相关。结论:在BLM致大鼠肺间质纤维化中,EMT通路关键蛋白起到重要作用,甘草酸能够干预EMT及上述蛋白的活化。第三部分甘草酸通过CF修饰调控EMT的机制目的:探讨核心岩藻糖基化修饰对EMT关键信号通路的影响,深入解析甘草酸调控FUT8阻抑EMT。方法:利用BLM致大鼠肺间质纤维化模型,观察核心岩藻糖基化修饰水平变化及核心岩藻糖基化修饰对TGF-β/Smad2/3、Wnt/β-catenin信号通路的影响,深入解析甘草酸对核心岩藻糖基化修饰的水平变化。首先免疫荧光双染法观察大鼠肺脏中CF表达及甘草酸对大鼠肺脏CF修饰水平的变化;其次应用免疫荧光、免疫印迹检测TGF-βR、WNT核心岩藻糖基化水平及甘草酸对上述受体蛋白及CF修饰水平变化。结果:正常肺脏组织中存在中等量的CF修饰水平。与正常组比较,BLM致大鼠肺间质纤维化中,CF修饰水平明显增加;大鼠肺脏中TGF-βR、WNT及其核心岩藻糖基化水平显著升高(p<0.001);甘草酸能明显抑制BLM诱导纤维化大鼠肺脏中TGF-βR、WNT受体蛋白的核心岩藻糖基化修饰水平(p<0.01),但是并未影响受体本身的表达。结论:在BLM致大鼠肺间质纤维化模型中,关键受体蛋白TGF-βR、WNT翻译后CF修饰在EMT中起到关键作用,甘草酸调控TGF-βR、WNT核心岩藻糖基化修饰后能够干预EMT,进而减轻肺间质纤维化。