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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前世界范围内应用最广泛,的一种生防微生物,对人畜及非靶标昆虫无害,具有巨大的经济价值和生态价值。为了克服害虫抗性发生、Bt杀虫图谱窄等问题,筛选具有高效杀虫活性的新型Bt基因就具有了非常重要的现实意义。本研究选取河北省大茂山地区为土壤样品采集地区,以地表以下5公分的腐殖土作为采集对象,根据不同海拔高度,共采集土壤样品784份,利用温度-抗生素筛选法分离得到76株分离菌株。显微观察结果表明这些菌株的伴孢晶体包括菱形、圆形、方形、椭圆形、不规则形等多种形态,充分体现了大茂山地区Bt资源的丰富及多样性。采用PCR-RFLP体系对分离获得的76株分离菌株进行基因鉴定,结果发现含有cry1、cry2、cry3、cry8、cry9、cry26、cry1I和vip共8种基因型,其中包含有cry8类基因的菌株最多,有34株,另外12株包含有cry1类基因,5株包含有cry2类基因、2株包含有cry3类基因、7株包含有cry9类基因、6株包含有cry26类基因、11株包含有cry1I类基因,3株包含有vip基因。在基因组合方面,cry8+cry9基因组合最多,有7株,cry3+cry8基因组合为1株,cry1+cry2基因组合为5株,cry8+cry26基因组合为6株。此外有26株分离菌株未鉴定出基因型,可能含有未知类型的基因,需要借助其他方法进一步研究。SDS-PAGE蛋白晶体分析结果表明,包含有cry1类基因的菌株表达130 kDa大小的蛋白,同时包含有cry1类和cry2类基因的菌株表达130 kDa和60 kDa大小的蛋白,包含有cry8类基因的菌株表达130 kDa大小的蛋白,同时包含有cry8类和cry9类基因的菌株表达130 kDa和80 kDa大小的蛋白,同时包含有cry3类和cry8类的菌株表达130 kDa大小的蛋白,未鉴定出基因型的菌株表达蛋白大小多种多样。测定了76株菌株对小菜蛾、棉铃虫、华北大黑鳃金龟、铜绿丽金龟、暗黑鳃金龟幼虫的生物活性。结果表明,10株对鳞翅目昆虫毒力较高,4 d校正死亡率可达到100%,4株对华北大黑鳃金龟毒力较高14 d校正死亡率可达70%以上。菌株TDM-19在对铜绿丽金龟的生物活性测定中表现出较高活性,14 d校正死亡率为100%,其LC50为2.4943×108芽胞/ml菌液,杀虫效果高于对照菌株HBF-1。该菌株表达97 kDa、66 kDa、45 kDa的三条条带的蛋白,而并未表达一般对鞘翅目昆虫有活性的130 kDa蛋白。使用PCR-RFLP体系对其进行鉴定,在27种通用引物范围内未获得预期片段。利用Bt cry基因的简并引物OL1/OL5对其保守序列进行扩增,得到900 bp左右基因片段,其测序结果在基因序列比对中未发现与之具有较高相似性的已公布cry基因,推测含有新型基因,具有较高研究价值。从菌株FB-32的总DNA中克隆得到了全长的cry8Ca3基因,该基因编码区为3483 bp,包含1160个氨基酸,分子量为130.32 kDa,等电点为4.74,为弱酸性氨基酸。提交EMBL/GenBank基因库注册,登录号为EU625349,并由Bt毒蛋白基因国际命名委员会命名为cry8Ca3基因,是第4等级新基因。