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普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是α-淀粉酶家族GH13中的一种脱支酶，特异性地作用于支链淀粉、普鲁兰糖和糖原中的α-1，6-糖苷键。在淀粉水解过程中，能特异地性地水解支链的α-1，6-糖苷键，产生直链淀粉;它还可以将最小单位的支链分解，最大限度地利用淀粉原料，加速糖化过程，从而有效地提高淀粉水解效率和利用率。普鲁兰酶能水解淀粉的支链的特性，使其成为淀粉酶解制剂中的重要一员，具有广阔的应用前景。 本论文通过筛选普鲁兰酶产生菌，克隆其编码基因，并对普鲁兰酶进行异源表达和酶分子改造，以获得高表达量的耐酸普鲁兰酶的基因工程菌。主要研究工作如下: 首先，利用以普鲁兰糖为唯一碳源的含中性红为指示剂的基本培养基平板筛选法，筛选分离到一株产普鲁兰酶的GST4菌株，通过形态学、生理生化试验及16S rDNA分类鉴定，确定该菌株属于Tumebacillus属的新种，并将该新种命名为膨胀芽孢杆菌（Tumebacillus flagellatus）。通过基因组测序获得了T.flagellatus sp.nov GST4的基因组序列草图，这有助于识别该属的进化地位和生态作用，同时该菌各种淀粉水解酶的成功注释，为下一步对这些酶的克隆表达提供了基因序列信息。 对T.flagellatus sp.nov GST4的普鲁兰酶基因pulB进行了克隆表达和酶学性质分析。该酶的最适反应温度和最适反应pH分别为55℃和pH5.0，在pH4.0～6.0酸性条件下酶活力比较稳定;酶促反应符合米氏常数，对普鲁兰糖的Km为16.28±0.03mg·mL-1，Vmax为22.05±0.02μmol·min-1.mg-1;它可水解普鲁兰糖、支链淀粉产生麦芽寡糖或三糖。由GenBank数据库的blastx结果可知，该基因编码的产物与蛋白质为来自Thermicanus aegyptius的环麦芽糖糊精酶的氨基酸序列相似性最高，Identities为54％，Positives为69％，是从未有人报道过的相对新颖的普鲁兰酶。本研究挖掘了新的普鲁兰酶，为普鲁兰酶开发及酶的分子改造提供了基因资源。 为了获得耐酸性更好的普鲁兰酶，将实验室已经初步改造的长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体PulA324作为原始酶，采用易错PCR(error-prone PCR，epPCR)方法构建突变体文库。为了高效筛选到低pH值条件下酶活力和比活力进一步提高的突变体，利用自动诱导培养基和两相酶活力检测（分别检测pH5.0和pH4.0下的酶活力）相结合的96孔板高通量筛选方法进行突变体筛选。经过4轮进化，突变体PulA12(E256N&D520R)在较宽的酸性范围下耐受性较原始酶提高，在4℃、pH4.0条件下保留5.5h后，突变株的残余酶活力在pH4.0时仍有75％左右，而原始酶只残余20％，前者为后者的2.75倍。采用基于理性设计的定点突变策略，通过同源建模分析，结合基于酸性和碱性氨基酸残基的pKa值计算选点，对活性位点附近的三个氨基酸残基E326、N680和D570进行定点突变或定点饱和突变，成功获得了在pH4.0～5.0范围内酸稳定性提高2倍的突变体N7-6。测序结果表明该突变体的680位天冬酰胺被替换成天冬氨酸。 最后，将突变体基因插入表达质粒pWB980并导入枯草芽孢杆菌WB600构建工程菌株，通过发酵工艺的优化，胞外普鲁兰酶活力达到了348U/mL，超过了国内文献报道的最高水平。