基于SIRT1通路研究黄芪甲苷、蚓激酶对氧化应激状态下NRK-52E细胞的保护作用

来源 :西南医科大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:zty85633278
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目的:研究黄芪甲苷、蚓激酶在NRK-52E细胞氧化应激状态下对SIRT1通路相关因子的调节作用以及对细胞的抗氧化保护。  方法:选择大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),进行复苏与传代试培养后,采用随机分组法将细胞分为正常组(Norm)、模型组(H2O2)、白藜芦醇组(Res)、黄芪甲苷组(AS-Ⅳ)及蚓激酶组(Lumb)。每组细胞进行分皿接种培养,当铺板率达到75-85%时,分别予以不同的药物预处理24h,其中:Res组加入25μmol/L的白藜芦醇培养液,AS-Ⅳ组加入25mmol/L的黄芪甲苷培养液,Lumb组加入150U/mL的蚓激酶培养液,Norm组和H2O2组不作处理;24h后,除Norm组外,各组均加入300μmol/L H2O2的细胞培养液处理30min,30min后终止刺激,PBS换液,观察各组细胞在镜下普通白光的形态表现;收集细胞,用Western blot检测SIRT1通路中SIRT1、Nrf2、SOD2、FOXO3α、PGC-1α的蛋白表达量;收集细胞,将细胞裂解后用MDA试剂盒及酶标仪检测各组细胞MDA反应OD值;使用CCK8试剂与酶标仪检测各组细胞生长活力反应OD值;使用带荧光的多功能酶标仪检测各组细胞ROS探针OD值;使用流式细胞检测仪测试各组ROS荧光探针表达量;使用荧光倒置显微镜观察各组细胞内ROS探针的荧光强度。实验数据由统计分析软件SPSS22进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。  结果:1.细胞形态变化:与Norm组相比,H2O2组细胞出现背光通透性增高、坏死细胞增多以及细胞连接破坏的表现,Res、AS-Ⅳ、Lumb三组与H2O2组相比均有改善;2.CCK8:(1)用H2O2与药物分别刺激24h(药物组未加H2O2):H2O2组的细胞活力较Norm组明显下降(P<0.05),且随H2O2浓度增加而降低;Res、AS-Ⅳ、Lumb三组的细胞活力在低剂量时与Norm组没有差别,在高剂量时,Res与AS-Ⅳ两组细胞活力较Norm组增加(P<0.05),而Lumb组较Norm组细胞活力降低(P<0.05);(2)H2O2刺激30min(药物组已加H2O2):在刺激结束后1h内,各组细胞的OD值反应活力没有明显改变;在刺激结束后1.5h后,与Norm组相比,H2O2组的细胞活力下降(P<0.05);3.ROS荧光探针OD值:(1)与H2O2组相比,各组的荧光OD值均较低(P<0.05);(2)与Norm组相比,Lumb组的荧光OD值较高(P<0.05);4.MDA:(1)与H2O2组相比,各组MDA值均较低(P<0.01);(2)与Norm组相比,Res组和Lumb组MDA值较高(P<0.05);5.Westemblot:(1)SOD2:与H2O2组相比,Norm组、Res组、AS-Ⅳ组和Lumb组SOD2表达均升高(P<0.01);与Norm组相比,Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组SOD2表达均降低(P<0.01);(2)n-NRF2:与H2O2组比,Res组、AS-Ⅳ组n-NRF2表达升高(P<0.05),Norm组、Lumb组n-NRF2表达降低(P<0.01);与Norm组相比,Res组、AS-Ⅳ组n-NRF2表达升高(P<0.05);(3)PGC-1α:与H2O2组相比,Norm组、Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组PGC-1α表达均升高(P<0.01);与Norm组相比,Res组、AS-Ⅳ组PGC-1α表达升高(P<0.01),Lumb组表达降低(P<0.05);(4)SIRT1:与H2O2组相比,Norm组、Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组SIRT1表达均升高(P<0.01);与Norm组相比,Res组、AS-Ⅳ组SIRT1表达升高(P<0.01);(5)FOXO3α:与H2O2组相比,Norm组、Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组FOXO3α表达均升高(P<0.01);与Norm组相比,Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组FOXO3α表达升高(P<0.01);6.流式检测ROS探针:(1)和H2O2组相比,Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组的荧光细胞阳性率均降低(P<0.05):(2)和Norm组相比,H2O2组、Res组、AS-Ⅳ组、Lumb组的荧光细胞阳性率均升高(P<0.01);7.荧光倒置相差显微镜:Norm组1(无荧光探针)无法看到细胞或荧光背景,Norm组2(有荧光探针)能看到背景的绿色杂质,H2O2组荧光强度最强,Lumb组次之,Res组与AS-Ⅳ组较弱。  结论:黄芪甲苷、蚓激酶都提升了NRK-52E细胞抗氧化能力,减轻了H2O2对细胞的氧化损害。其中黄芪甲苷对SIRT1通路相关抗氧化因子具有上调作用,其作用机制与白藜芦醇相似;蚓激酶不能上调SIRT1,但能保护SIRT1在氧化应激状态下不被抑制,同时直接或间接激活FOXO3α-SOD2通路产生抗氧化作用。
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