论文部分内容阅读
国槐(Sophora japonica Linn.)为我国重要的药用植物资源,其根、枝、皮、叶、花、果中均含有黄酮类(flavonoids)成分,几乎全株入药。其中《中国药典》规定的中药槐米含有质芦丁(rutin,约13%~28%)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)及其糖苷等成分;槐角中除含有上述成分外,还含有异黄酮类(isoflavones)物质等。国槐入药部位功能与成分不仅具有清热泻火、止血、降血压、抗氧化、延缓衰老、抗炎、镇痛、抗骨质疏松、抗肿瘤、明目益气等药理作用,还是重要的观赏树种及蜜源树种,在药用种质收集与挖掘、现代林业与景观生态的发展等方面具有极为巨大的应用前景。但是其种质资源研究技术缺失、精准鉴定和系统评价不足。本论文旨在开发g SSR、EST-SSR和cp SSR标记的基础上,建立了国槐无性系分子鉴别技术及分子身份证数据库;对国槐古树及栽培群体进行STRUCTURE群体分析、分子方差分析、聚类分析与亲缘关系分析。研究表明,国槐古树及现代栽培群体的种质资源遗传多样性水平相对较高。基于等位基因位点数目最大化策略筛选了186个无性系,可作为将来构建国槐核心种质的组成部分,提出了国槐种质资源收集与分类规范保护管理策略,为国槐种质资源的保护评价与创新利用提供了依据和支撑。获得以下主要结果:(1)SSR引物开发、验证与筛选。基于磁珠富集及测序法,获得30条核基因组序列,设计41对g SSR引物,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳复选28对,终选9对;通过高通量测序平台进行国槐无性系叶片de novo测序,从7520个EST-SSR位点中综合筛选并设计EST-SSR引物100对,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初选59对,复选30对,终选12对;使用高通量测序平台进行堇花槐叶绿体基因组de novo测序,从全基因组171个cp SSR位点中筛选、设计引物51对,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初选10对,复选为6对,终选3对。不同来源的引物、同一来源不同引物在遗传参数评估、亲缘关系分析及STRUCTURE亚群体划分等方面均存在一定差异,宜选用双亲遗传标记及单亲遗传标记开展国槐相关研究。终选的3对cp SSR、9对g SSR和12对EST-SSR引物在槐属和马鞍树属的平均通用率达66%以上,其在5个国槐栽培群体100个个体中的位点多态性水平较高;但是变异较小,且主要来源于个体间(74%)、其次为群体内(22%),群体间最少(4%);亲缘关系较近,其中北京市国槐栽培群体与辽宁省国槐栽培群体的亲缘关系最近,与山东省国槐栽培群体、河南省国槐栽培群体、山西省国槐栽培群体的亲缘关系依次渐远。NJ法聚类将100个个体划分为2组,Ⅰ组包含17个个体,Ⅱ组包含83个个体,STRUCTURE分析也建议划为2个亚群体,国槐古树栽培群体内的迁入个体较少。(2)依据特异等位基因及等位基因鉴别国槐无性系。64个国槐无性系通过特异等位基因片段信息进行鉴别。24对SSR引物扩增等位基因片段长度的小值、大值和大小双值信息的鉴别能力依次增高,535个国槐无性系中的2个可能为异名同物。采用其中14对SSR高效引物组合构建了534个国槐无性系的分子身份信息数据库,并将其每个无性系的分子身份信息与档案信息转化为可视化的二维码图形数据库。(3)开展国槐遗传多样性评价,制定保护利用策略。国槐古树存在明显的群体结构,遗传多样性较丰富,经度方向上的遗传多样性高于纬度方向上的遗传多样性。其中,经度方向上从西到东逐渐降低再稍微增高,遗传分化处于中低水平;纬度方向上自中部向南北方向降低,遗传分化水平总体较低,其变异来源于个体间(68%~69%)、群体内(28%~30%)和群体间(1%~2%);国槐二级古树栽培群体与国槐一级古树栽培群体关系最近,与国槐的三级古树栽培群体、现代栽培无性系、栽培品种的亲缘关系依次渐远;分别加入白刺花和侧花槐2个同属外类群及来自美国和韩国的国槐种质资源之后,上述亲缘关系总体未变。其遗传距离较小、遗传一致度较大,其亲缘关系总体较近,可能来源于2个STRUCTURE亚群体。优树选择是其变异的主要利用途径,应采取原地保存与异地保存相结合的方式开展国槐种质资源保护与利用。(4)基于等位基因位点数目最大化策略、逐步聚类法及随机取样法构建了当前国槐种质资源样本的核心种质。基于等位基因位点数目最大化策略及逐步聚类法可以更好的获得国槐的核心种质。其中,基于等位基因位点数目最大化策略筛选的核心种质(186个无性系),其等位基因数量最高(378个),保留率达97.4%;其次为基于逐步聚类法获得的核心种质(155个无性系),其等位基因保留率达到95.8%。筛选的186个无性系在国槐原有种质的主坐标分布图、三维分布图中分布较均匀,t检验结果虽然未达到显著水平,但是相关数据支持等位基因位点数目最大化策略筛选的种质为国槐的重要种质,可作为将来国槐核心种质构建的重要组成部分。