论文部分内容阅读
毒素-抗毒素系统广泛分布在细菌与古菌基因组上，参与微生物的生长代谢调控。随着近些年对Ⅱ型毒素-抗毒素系统广泛深入的研究，发现基因组上编码的Ⅱ型毒素可作为RNase，切割胞内特定的RNA分子来调节胞内代谢速率。Shewanella oneidensis MR-1分离自Lake Oneida，是首株完成全基因测序的希瓦氏菌，由于其具有金属氧化还原能力而得到广泛的关注与研究。S.oneidensis生存环境复杂多变，分析其基因组发现存在多对可能的毒素-抗毒素系统。本研究选取其中的两对Ⅱ型毒素-抗毒素系统SO_3166-SO_3165和SO_1444-SO_1445作为研究对象。目前取得了以下研究成果: SO_3166-SO_3165位于S.oneidensis基因组上， SO_3166属于HEPN超家族，SO_3165属于MNT超家族。生物信息学分析发现，HEPN-MNT成对存在时是微生物基因组上丰度最高的毒素-抗毒素系统。在E.coli和S.oneidensis宿主中，过表达SO_3166能够显著抑制生长。而SO_3165作为抗毒素，与毒素共同表达时能够中和SO_3166的毒性，单独过表达对宿主无任何毒性。SO_3165位于SO_3166的上游，两者的编码区存在4个碱基的重叠。通过引物延伸实验发现两个基因是共转录的，并且两个基因均编码蛋白。SO_3165直接与SO_3166通过蛋白-蛋白相互作用来中和毒素的毒性，符合Ⅱ型毒素-抗毒素系统的特性。通过体外EMSA实验和体内β-半乳糖苷酶实验发现SO_3165能够结合到自身的启动子区域抑制自身的转录。HEPN家族主要作为核酸内切酶发挥功能，预测存在保守结构域Rx4-6H对其活性具有关键作用;分析发现SO_3166序列中也存在一个Rx4H区域，且点突变R和H均能够导致毒素毒性的消失，这也预示着SO_3166可能是作为核酸内切酶在胞内发挥功能。在敲除SO_3166-SO_3165的突变株中我们发现S.oneidensis的游动能力有所增加。本研究首次证实了HEPN-MNT(SO_3166-SO_3165)家族成对存在作为Ⅱ型毒素-抗毒素发挥作用。 SO_1444-SO_1445位于S.oneidensis的原噬菌体CP4-57So上，同源序列比对发现SO_1444-SO_1445高度保守的存在于亲缘关系较近的希瓦氏菌属中，且都位于可移动遗传元件上，推测它与原噬菌体的稳定性之间存在关系。在E.coli和S.oneidensis宿主中，过表达SO1444能够显著抑制微生物的生长，形态观察发现细胞发生明显的丝裂状生长以及染色质分布不均匀。形态变化与用环丙沙星（解旋酶抑制剂）处理相似，推测毒素可能作为解旋酶抑制剂发挥作用。SO_1445作为抗毒素，能够通过直接的蛋白-蛋白相互作用中和毒素SO_1444的毒性并且对自身启动子进行反馈调节。荧光定量结果显示，SO_1444-SO_1445能够维持原噬菌体CP4-57So在基因组上的稳定存在。