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多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，PAH)是环境中一类分布广泛的持久性有机污染物。苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene，BaP)作为代表性的PAH具有包括神经毒性和生殖毒性在内的多种毒性。截至目前，关于BaP神经毒性的研究大多集中于高浓度或短期的暴露实验，而环境水平浓度下、长期的BaP暴露是否能引起同样的神经毒性则研究得较少;此外，胚胎时期低浓度BaP暴露对成年阶段的神经毒性、生殖毒性效应及其机制研究更为少见。因此本研究以斑马鱼为模式动物，分别进行环境水平浓度(0，0.05，0.5，5，50nmol/L)BaP长期暴露和胚胎时期短暂暴露（后正常清水中养至一年大），并利用行为学、病理学、生物化学、分子生物学等手段，研究BaP的神经毒性和生殖毒性，分析其可能的毒性作用机制。本研究主要结果如下: (1)对斑马鱼从0.5-1.5hpf（hours post fertiliaztion，受精后小时数）的胚胎时期开始连续暴露低剂量BaP至230天后，斑马鱼运动距离和平均运动速度均显著下降;学习记忆能力减退;斑马鱼脑体比显著下降;端脑和间脑内多巴胺神经元数量显著减少;端脑出现神经元退化现象，神经元密度显著降低;脑内β淀粉样蛋白含量增加;端脑和间脑内细胞凋亡显著增加;脑内多巴胺、二羟基苯乙酸、乙酰胆碱含量显著降低;与神经退行行性疾病相关的dat，dj-1，pink1，uch-11，lrrk2，psen1，psen2和appb的mRNA表达均发生下调。由此可见，BaP长期暴露可导致斑马鱼产生神经退行性疾病类似症状。 (2)对0.5-1.5hpf的斑马鱼胚胎连续暴露低剂量BaP至96hpf后转至清水中养到一年大，检测其引起的神经毒性。结果显示，成年斑马鱼的运动能力和学习记忆能力均显著下降;脑内β淀粉样蛋白含量增加;端脑和间脑内的多巴胺神经元数量显著减少;端脑总神经元密度显著降低;三种神经递质（多巴胺、二羟基苯乙酸、去甲肾上腺素）含量均显著降低。由此可见，胚胎时期低剂量BaP暴露可导致成年斑马鱼产生神经退行性疾病类似症状。进一步对96hpf的仔鱼和成鱼脑进行相关蛋白的western blot分析。结果显示，DNMT1和DNMT3a在仔鱼和成鱼脑内表达量均显著上升。应用甲基化高通量测序技术，我们筛选到在启动子区域发生差异甲基化的gucy2f、drd4-rs和zc4h2，这三个基因均与神经系统发育相关。通过BSP(Bisulfite sequencing PCR)验证，其中，gucy2f和drd4-rs在96hpf仔鱼和成鱼脑内均保持高甲基化状态，Real-time PCR结果显示它们的mRNA表达水平则成下降趋势;相反，zc4h2在96hpf仔鱼和成鱼脑内保持低甲基化状态，mRNA表达水平成上升趋势。基于此，我们认为胚胎时期低剂量的BaP暴露可导致gucy2f、drd4-rs和zc4h2持久的DNA甲基化改变，进而引起成年斑马鱼发生神经退行性病变。 (3)对0.5-1.5hpf的斑马鱼胚胎连续暴露低剂量BaP至96hpf后转至清水中养到一年大，检测其引起的生殖毒性。结果显示，成年雄鱼的性体比呈倒U型变化;组织学检查发现精巢内成熟精子数量显著减少;与正常雌鱼交配后所产胚胎的受精率、出膜率显著下降，畸形率显著升高;雄鱼肌肉组织中睾酮含量无明显变化，雌二醇含量增加;Real-time PCR结果显示雄鱼脑内GnRH3、Fshβ、LHβ、LHγ、cyp19a1a及cyp19b的mRNA表达量均显著下降;精巢内cyp19a1a及cyp19b表达量显著降低，雌激素受体esr1和esr2β的mRNA表达量上升。成年雌鱼性体比显著下降，产卵量显著下降;卵巢切片结果显示，成熟卵母细胞数量和面积显著降低;与正常雄鱼交配后所产胚胎的受精率、出膜率和蛋白含量均显著降低，畸形率显著增大;雌鱼肌肉组织中睾酮与雌二醇含量均显著下降;Real-time PCR结果显示雌鱼脑内GnRH3、Fshβ、LHβ、LHγ、cyp19a1a及cyp19b的mRNA表达量均显著下降;卵巢内cyp19a1a、cyp19b、esr1和esr2β的mRNA表达量均显著降低;雌鱼肝脏内vtg1、vtg2、esr1和esr2β的mRNA表达量均显著降低。甲基化高通量测序结果显示，BaP暴露后斑马鱼gnrhr3启动子区域发生了高甲基化。通过BSP验证，发现在96 hpf仔鱼和成年雌鱼、雄鱼脑内gnrhr3均保持高甲基化状态，而mRNA表达水平则呈下降趋势。基于以上结果，我们认为胚胎时期低剂量BaP暴露引起的生殖毒性效应机制可能与“脑-垂体-性腺轴”中与生殖相关基因的mRNA表达异常有关。同时与gnrhr3启动子区域发生高甲基化有关，且这种高甲基化状态一直维持到成年;脑中gnrhr3启动子区域的高甲基化降低了该基因mRNA的表达，导致GnRH3和gnrhr3结合受限，进而抑制垂体中FSH和LH的释放，进一步影响性腺中性激素的合成与分泌，最终对精巢和卵巢的发育与成熟产生显著影响，表现为成年斑马鱼的生殖能力降低。 根据以上结果我们认为，长期环境水平的BaP暴露可导致斑马鱼在行为、病理、神经递质等方面产生与神经退行性疾病较为相似的症状，提示BaP可能是一种新的神经退行性疾病环境风险因子。胚胎时期低剂量BaP短期暴露对成年斑马鱼产生的毒性效应，可能是BaP暴露引起的表观遗传改变导致的。