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芥蓝(Brassica alboglabra Bailey)为十字花科芸薹属一二年生草本植物,原产于中国南部,是我国著名的特产蔬菜之一.近年来,由于芥蓝反季节栽培面积的扩大,在栽培过程中常常受到病虫等严重危害,给生产造成很大的损失,因此,选育抗虫品种成为芥蓝育种的主要目标之一.通过常规育种手段从现有资源中选育出多抗、高抗、优质、高产品种难度大,耗时长.而通过基因工程技术对芥蓝的性状进行人工改良无疑是一条快捷有效的途径.苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性菌,它的杀虫晶体蛋白基因是目前应用最为广泛的抗虫基因.
本实验应用基因枪法和农杆菌转化法将Bt抗虫基因Cry2Aa2导入芥蓝品种"小香菇"中,建立了适应基因枪和农杆菌介导两种转化方法的再生体系,并对两种转化体系进行了优化,获得了转基因植株.主要研究结果如下:
1.芥蓝的再生体系
(1)分化效率最高的外植体是下胚轴和带一片子叶的下胚轴.其中下胚轴适合基因枪法转化,带子叶的下胚轴适合农杆菌介导法转化.
(2)下胚轴和带子叶的胚轴的最佳分化培养基分别是MS+0.01mg/L NAA+2mg/L6-BA+3％蔗糖+0.8％琼脂和MS+0.05mg/L NAA+2mg/L 6-BA+3％蔗糖+0.8％琼脂.
(3)最佳生根培养基：MS+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.8％琼脂。
2.芥蓝遗传转化体系
(1)基因枪转化法。下胚轴经预培养2天,轰击前在高渗培养基中培养4h,轰击后高渗培养24h,之后转入普通分化培养基中恢复培养一周后转入筛选培养基中筛选.在轰击距离为6cm,轰击次数为1次时,转化效率最高.筛选培养基中Spc的浓度为3mg/L.
(2)农杆菌转化法。带子叶的下胚轴预培养2d,侵染10min,共培养2d,抑菌培养5天后转入筛选培养基上筛选,最适合农杆菌转化-抑菌培养基为MS+0.05 mg/LNAA+2mg/L 6-BA+300mg/Lcef+3％蔗糖+0.8％琼脂：筛选培养基为MS+0.05 mg/L NAA+2mg/L BAP+300mg/Lcef+5mg/L Km+3％蔗糖+0.8％琼脂.
3.转基因植株的检测
基因枪转化法和农杆菌介导法获得的抗性植株PCR检测呈阳性的植株分别有3株和15株.经PCR-Southern检测,分别有2株和4株证实目的基因已转入植株.
4.抗虫性检测
将甘蓝夜蛾放在培养皿中24小时后,未转基因的叶片受到的损害严重,而转基因的叶片受损伤相对较小.继续饲喂转基因叶片3日后,盛有转基因叶片的培养皿内的一只甘蓝夜蛾幼虫死亡.初步证明,转基因叶片具有抗虫功能.