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水稻(Oryzasativa L.)花药发育机制研究具有极其重要的理论和实践意义，近年克隆了一系列控制花药发育的重要基因，但仍有许多机制需要阐明。 RNAi(RNA interference，RNA干扰)是功能基因组研究的有效手段，通过失活目的基因研究基因功能，由于其需要将目的片段转变为反向重复结构，传统方法需要首先将正义片段克隆到载体内含子序列一端，再将反义片段克隆到重组载体内含子序列另一端，从而形成反向重复结构。但这种方法只能对特定基因逐个进行操作，不能用于构建大量基因的RNAi文库。 本研究通过SMART-PCR扩增方法获得水稻花药组织的cDNA文库，利用抑制缩减杂交富集水稻花药表达基因3’端序列，并利用滚环复制(Rolling Circle Amplification，RCA)方法将抑制缩减产物在体外转变为反向重复结构，旨在构建水稻花药表达基因的RNAi文库，这对于水稻花药发育研究具有重要意义。本文取得的主要研究结果如下： 1.改进了SMART-cDNA文库构建方法，在cDNA文库基因3’端引入MmeI酶切位点，可删除逆转录反应产生的3’端polyT序列，以避免polyT序列对RNAi可能造成的影响。 2.利用经改进的抑制缩减杂交技术，富集了水稻花药特异表达基因3’端序列。 3.改良了在体外构建内含子间隔的反向重复结构方法，设计了具有更大内含子间隔的发夹接头，增加了反向重复结构在细菌体内的稳定性，提高了构建RNAi文库的效率。这种方法同样适用于特定片段反向重复结构的体外构建。 4.对本实验室的RNAi载体进行了改造，在克隆位点两端插入了loxP位点。在RNAi转化水稻产生表型后，与本实验室已有的Cre酶转化系杂交，可以删除RNAi结构，从而区分RNAi效应造成的突变与随机插入突变。 5.用改良的RCA方法构建了一个富集水稻花药表达基因的RNAi文库。初步测序得到了50多个单一基因的RNAi结构。通过检索芯片表达谱，确认其中20个克隆包含花药特异表达基因3’端片段，其余的为花药以外组织也表达的基因。克隆长度介于200-600bp，且绝大部分克隆为真实的内含子间隔的反向重复结构。 6.选取部分克隆转化中花11，成功得到了转化体，相关表型鉴定工作正在进行中。 本水稻花药表达基因RNAi文库的构建，不仅对研究水稻花药发育过程具有重要意义，也为构建植物组织特异表达基因RNAi文库提供了技术支持。