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叠朊蛋白(Dpl)是与朊蛋白(PrPc)同源的一种糖基磷脂酰肌醇锚定(GPI)的结构糖蛋白,由于它们两者具有相似的结构特征,因此Dpl蛋白结构和功能的研究为朊病毒病的研究开辟了新的思路和方向,成为传染性海绵状脑病研究的标志性蛋白和新的焦点。BALB/c小鼠是研究多种疾病发病机理的理想实验动物之一,它具有发病快、症状典型的特点,是研究包括神经退行性在内的多种疾病发生机理的重要模型动物。
本研究利用分子生物学技术和免疫学技术,对BALB/c小鼠叠朊蛋白基因Prnd进行了克隆、表达,并制备兔抗Dpl多克隆抗体;对叠朊蛋白在BALB/c小鼠睾丸中的分布及其在BHK细胞的表达情况进行了研究,为进一步阐明叠朊蛋白的功能及其在疾病发生、发展过程中的作用提供了基础数据。本研究共分为3部分内容:
1、BALB/c小鼠叠朊蛋白基因的克隆及序列分析。以BALB/c睾丸总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了BALB/c小鼠叠朊蛋白基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序,运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析。结果表明,所克隆的BALB/c小鼠叠朊蛋白基因共540个核苷酸,编码179个氨基酸残基的蛋白,推测其相对分子质量约20.4kDa。与已报道的绵羊、家鼠、猪、牛、人相应序列作比较,发现其核苷酸序列和氨基酸序列具有较高的同源性。对BALB/c小鼠叠朊蛋白基因及其编码的氨基酸序列进行分析,发现了3个突变位点,只有L5V可以引起氨基酸变化,其余均为同义置换,并获得了叠朊蛋白的结构域。
2、BALB/c小鼠Dpl蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备。以含有BALB/c小鼠Dpl蛋白基因Prnd的重组质粒pMD18-T-Prnd为模板,扩增带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的基因片段,亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,成功构建了原核表达质粒pGEX-6P-1-Prnd,转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,将目的蛋白纯化后制成油乳剂免疫新西兰大白兔,制备了兔抗鼠Dpl多克隆抗体。双向琼脂糖凝胶扩散和间接ELISA法测得抗体效价较高。Western blot结果表明,抗体有较高的特异性,获得了效价高,特异性好的兔抗Dpl多克隆抗体。利用制备的抗体,采用免疫组织化学技术对Dpl蛋白在小鼠睾丸组织的分布进行了研究,结果表明,叠朊蛋白分布于小鼠睾丸曲精小管除基底层细胞外包括精子在内的细胞。
3、pIRES2-EGFP-Prnd真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的初步表达。以含有BALB/c小鼠Dpl蛋白基因Prod的重组质粒pMD18-T-Prnd为模板,扩增带有XhoⅠ和PstⅠ酶切位点的基因片段,经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达载体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-Prnd进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到BHK细胞,荧光显微镜观察其表达情况并进行IFA检测。结果表明,真核表达载体pIRES2-EGFP-Prnd构建成功并可以在BHK细胞中表达,该表达载体可以作为研究Dpl蛋白生理功能的重要工具。