口腔鳞状细胞癌血清肿瘤标志物AC007271.3的初步功能研究

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目的:  筛选出口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的血清肿瘤标志物,并在OSCC中对筛选出的lncRNA-AC007271.3进行初步功能研究。  方法:  1.采用lncRNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片,筛选出OSCC及癌旁对照口腔黏膜组织中差异性表达的lncRNAs,并行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,qPCR)检测验证芯片结果。  2.检测分析OSCC患者组织和对应血样,以及OSCC细胞中lncRNAs的表达情况,进一步筛选出OSCC血清中特异性表达的lncRNA(AC007271.3)。  3.分别以qPCR及酶联免疫吸附法(ELISA)单独及联合检测80例OSCC患者及70例健康成人血清中AC007271.3和鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)、恶性肿瘤特异性生长因子(tumor supplied group of factors,TSGF)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和程序性细胞死亡蛋白(programmed death-ligand1,PD-L1)的表达水平,结合OSCC患者的临床参数,分析其临床意义。同时,应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)和决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)评估单独或联合检测血清中各标志物的诊断价值;采用Kaplan-Meier生存曲线评估OSCC患者总体生存情况。  4.以荧光原位杂交技术明确AC007271.3在OSCC细胞中的定位,进一步探讨AC007271.3的功能;敲减及过表达AC007271.3后,采用CCK-8、细胞克隆形成、划痕损伤修复、transwell基质胶侵袭及细胞凋亡实验,初步探讨AC007271.3对OSCC细胞生物学功能的影响。  5.采用免疫印迹及免疫荧光检测并探讨AC007271.3通过Wnt/β-catenin信号通路在OSCC发生发展过程中的重要作用。  结果:  1.基因芯片检测筛选出691条差异性表达的lncRNAs和816条差异性表达的mRNAs(433条lncRNAs表达上调,258条lncRNAs表达下调;342条mRNAs表达上调,474条mRNAs表达下调)。通过GO和pathway等生物信息学分析及qPCR实验,进一步筛选出在OSCC及癌旁对照口腔黏膜组织中存在显著差异的4条lncRNAs(AC007271.3,AC007182.6,LOC283481和RP11-893F2.9)(n=30,P<0.05)。  2.AC007271.3在OSCC患者组织及对应血清中的表达存在相关性(r=0.639,P<0.001),在OSCC细胞系及对应细胞外培养液中均上调,且术后患者血清中AC007271.3水平明显下降(P=0.002)。OSCC患者与健康成人血清中AC007271.3呈明显差异性表达(n=80and n=70,P<0.0001),其表达水平与患者肿瘤临床分期、分化程度和淋巴结转移密切相关。  3.将AC007271.3和SCCA进行联合检测,其诊断价值(AUC=0.902,P<0.001)明显优于二者单独检测,尤其在OSCC的早期阶段;OSCC患者血清中AC007271.3及SCCA高表达,提示其预后相对较差。此外,血清AC007271.3,SCCA和TSGF联合检测时的敏感度(77.6%,55%,63.3%)和特异性(84.5%,93.3%,66.7%)均具有优势。  4.AC007271.3在OSCC细胞质及细胞核中均有表达,体外实验结果显示,敲减AC007271.3,可以抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而过表达AC007271.3,可以促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭能力。  5.AC007271.3可以通过上调β-catenin及其下游分子Cyclin D1、c-myc及Bcl-2,激活Wnt/β-catenin信号通路。  结论:  AC007271.3是OSCC早期诊断的肿瘤标志物,可作为OSCC独立的预后因子。AC007271.3,SCCA和TSGF联合检测可用于OSCC的诊断。AC007271.3能促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,影响细胞凋亡,并且可通过Wnt/β-catenin信号通路在OSCC的发生发展过程中起作用。
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