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乏氧是多数实质性肿瘤微环境的基本特征之一。肿瘤细胞的快速增殖导致了乏氧微环境的建立,因此,乏氧环境信号成为影响肿瘤生物学行为的重要因素。乏氧环境下肿瘤血管形成增强、乏氧肿瘤细胞对放化疗的抵抗性升高,其恶性表型呈现显著增强。近年来,乏氧对肿瘤生物学特性影响及其调控机制的研究已成为肿瘤研究的热点领域,基于肿瘤乏氧特性的肿瘤治疗新策略已显示出了良好的前景。在肿瘤对乏氧微环境的适应过程中,诸多的肿瘤或宿主源性的因子参与其特性改变的调节,其中乏氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α）可能是肿瘤乏氧适应的关键调节因子。大量的研究已证实HIF-1α信号通路在许多肿瘤恶性表型的调节中起关键作用,但在口腔癌及舌鳞癌细胞系Tca8113细胞中的表达以及其对乏氧适应调控的机制报道甚少。大量的研究发现许多人类实体肿瘤中存在HIF-1的过表达,并被证实是调控肿瘤乏氧适应的关键核心转录调节因子。HIF-1基因是由HIF-1α和HIF-1β各两个亚单位组成的杂二聚体蛋白,其中α亚单位是唯一的O2调节亚单位。HIF-1α的稳定性、亚细胞定位及其促转录功能受细胞内氧浓度的调节。乏氧环境下,肿瘤细胞可通过上调HIF-1α的表达或减少蛋白的降解,导致其蛋白水平的升高及稳定性的增强,随后HIF-1α进入细胞核内与β亚单位聚合成异源二聚体,此二聚体特异性地与靶基因的乏氧反应元件（hypoxia-responsive elements,HRE）结合,发挥转录因子的作用。目前的研究发现HIF-1α直接调控的下游与乏氧适应反应有关的靶基因约100余个,HIF-1α通过不同的信号通路及机制调控肿瘤细胞的多种生物学行为,如细胞糖酵解、促血管生成及细胞的增殖、凋亡及侵袭等过程。新近的研究发现由于不同肿瘤的高度异质性,HIF-1α信号通路对肿瘤生长和演进的影响及调控机制可能存在较大的区别。舌癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤。在过去的三十年中,我国口腔癌的发病率呈逐年上升的趋势。舌癌的侵袭、转移及对放化疗的抵抗是导致治疗失败的重要因素,而乏氧微环境是关键影响因素之一。已证明人口腔癌组织中存在乏氧微环境,并发现HIF-1α过表达与口腔癌放化疗抵抗性密切相关,但HIF-1α对舌鳞癌细胞生物学行为（增殖、凋亡及侵袭）的影响及调控机制尚不清楚。新近的研究发现,肾上腺髓质素（Adrenomedullin,ADM）参与肿瘤生长及凋亡等生物特性调控,且其可能也是一个重要的乏氧诱导基因,参与肿瘤细胞乏氧适应的调控。有研究发现乏氧条件下HIF-1α和ADM表达均有上调,我们的前期研究也证实乏氧刺激可致舌鳞癌细胞系Tca8113细胞HIF-1α及ADM mRNA含量均显著上调,然而二者之间的关联,以及HIF-1α是否通过调节ADM的表达而致肿瘤细胞的恶性表型增强目前尚无报道。本研究拟以舌鳞癌细胞系Tca8113细胞为研究对象,采用siRNA干扰技术沉默HIF-1α基因,探讨其对Tca8113细胞增殖、凋亡及侵袭特性的影响,并探讨HIF-1α对ADM表达的调节作用。揭示HIF-1α在舌鳞癌细胞系Tca8113细胞的表达特点,及其调控新机制将对制订更为合理的基于乏氧特征的肿瘤治疗策略提供新的思路与有效靶点。第一部分乏氧对舌鳞癌细胞系Tca8113生物学行为及HIF-1α/ADM表达的影响目的:观察乏氧对舌鳞癌细胞系Tca8113细胞增殖、凋亡及侵袭性的影响,以及对HIF-1α及ADM基因的表达的影响。方法1.细胞培养:口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113在37℃,5%CO2饱和湿度条件下,培养于含10%胎牛血清,100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中。乏氧培养时,将80%融合的Tca8113细胞移至乏氧培养箱（1%O2、5%CO2、94%N2混合气体）继续培养4h,24h或48h。2.real -time PCR方法检测Tca8113细胞中HIF-1αmRNA的表达情况:收集经常氧或乏氧培养4h及24h的Tca8113细胞,Trizol方法提取细胞总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA,real -time PCR方法检测常氧及乏氧培养条件下HIF-1α在mRNA水平的表达情况。3.Western-blot检测HIF-1α蛋白表达情况:收集经常氧或乏氧培养4h及24h的Tca8113细胞,提取细胞总蛋白,Western-blot检测常氧及乏氧培养条件下HIF-1α蛋白表达情况。4.real-time PCR方法检测乏氧对ADM表达的影响:收集经常氧或乏氧培养2h、4h、8h、24h的Tca8113细胞,Trizol方法提取细胞总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA,real -time PCR方法检测常氧及乏氧培养条件下ADM在mRNA水平的表达情况。5.MTT方法检测乏氧对Tca8113细胞增殖的影响:取指数生长期细胞消化计数后按6×103/孔接种于96孔板中常氧培养过夜,然后乏氧培养6h、12h、24h、48h或72h,以常氧培养为对照,MTT方法检测细胞增殖情况。6.流式细胞仪检测乏氧对Tca8113细胞周期和细胞凋亡率的影响:取指数生长期细胞消化计数后按2×105/孔接种于6孔板中。待细胞融合至约80%,置入乏氧培养箱培养4h,24h或48h后收集细胞,PI染色后流式细胞仪检测细胞周期变化。乏氧培养4h,24h或48h后收集细胞,Annexin V-PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。7.CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒检测乏氧对Tca8113细胞黏附能力的影响:收集乏氧培养4h或24h的Tca8113细胞,取细胞悬液100μl（1×105个细胞）加入CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒中各孔,以常氧培养为对照,用490nm波长测定每孔的光吸收值（A）。8.细胞侵袭分析试剂盒检测乏氧对Tca8113细胞侵袭能力的影响:指数生长期细胞消化计数后,取细胞悬液300μl（3×105个细胞）加入细胞侵袭分析试剂盒的Boyden小室的上室,在下室加入500μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,常氧或乏氧培养4h或24h。光镜下计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数,评价细胞的侵袭能力。结果1.乏氧抑制Tca8113细胞的增殖:乏氧培养48h或72h后,Tca8113细胞增殖显著抑制（0.391±0.051 vs 0.537±0.046,P＜0.01;0.255±0.031 vs 0.852±0.078,P＜0.001）。2.乏氧可致Tca8113细胞周期阻滞于G1期:乏氧培养24或48h后,与常氧组比较,其G0/G1期细胞分别为（（73.37±4.01）%vs（66.59±5.25）%,P＜0.05;（87.62±6.54）%vs（61.88±4.38）%,P＜0.01）,有显著性差异。3.乏氧促进Tca8113细胞的凋亡率:乏氧培养4h或24h后,细胞凋亡率与常氧组比较,无显著性差异;乏氧培养48h后,Tca8113细胞凋亡率明显增加,与常氧组比较有显著性差异（11.56±1.82）%vs（4.37±0.59）%,P＜0.01)。4.乏氧增强Tca8113细胞的黏附和侵袭能力:乏氧培养4h或24h后,Tca8113细胞黏附能力增强,与常氧对照组相比有显著性差异（（126.0±9.3）%,（128.0±10.8）%vs（100.0±8.7）%,P＜0.05）。乏氧培养24h后,Tca8113细胞侵袭能力增强,与常氧对照组相比有显著性差异（（133.0±11.6）%vs（100.0±9.2）%,P＜0.05）。5.乏氧不影响Tca8113细胞HIF-1α的转录但其蛋白含量增加:常氧培养条件下,Tca8113细胞中有HIF-1αmRNA和蛋白的基础表达。乏氧培养4h或24h,Tca8113细胞中HIF-1αmRNA表达没有明显增加（P＞0.05）。但乏氧培养4h后HIF-1α蛋白表达量增加,乏氧培养24h后更为显著。6.乏氧上调Tca8113细胞ADM mRNA的表达:乏氧培养2h后,ADM mRNA的表达开始增加;乏氧培养24h后ADM mRNA的表达较常氧对照组增加17.5倍（P＜0.01）。结论1.研究阐述了乏氧微环境对Tca8113细胞生物学行为的影响,证实慢性乏氧（48h）可抑制Tca8113细胞的增殖,促进其凋亡,并能导致Tca8113细胞黏附和侵袭能力增加。乏氧还可导致Tca8113细胞周期阻滞在G1期。2.研究发现乏氧不影响Tca8113细胞HIF-1α的转录水平活性但其蛋白含量显著增多,证实乏氧对Tca8113细胞细胞生物学行为的影响是在转录后水平。3.本研究首次发现乏氧刺激上调Tca8113细胞ADM mRNA的转录活性,推测其上调可能与HIF-1α蛋白含量的增加有关。第二部分沉默HIF-1α对Tca8113细胞ADM表达及生物学行为的影响目的利用siRNA技术特异性阻断HIF-1α基因表达,研究HIF-1α对Tca8113细胞生物学行为的影响,以及对下游调控基因ADM表达的影响。探讨HIF-1α/ADM通路对Tca8113细胞增殖及侵袭性的影响及HIF-1α/ADM作为舌癌生物和基因治疗的潜在分子靶点的可能。方法1.针对HIF-1α的siRNA片段(siRNAHIF-1α)的转染:取指数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,细胞融合至40-50%时,应用LipofectamineTM 2000将50nM siRNAHIF-1α转染入Tca8113细胞。2.干扰效率的检测:转染24h后Tca8113细胞常氧或乏氧培养24h,real-timePCR及Western blot方法检测常氧或乏氧培养条件下siRNAHIF-1α对HIF-1αmRNA和蛋白表达的阻断效率。3.免疫荧光检测siRNAHIF-1α对HIF-1α蛋白表达的影响:取指数生长期细胞消化计数,按8×104个/孔接种于放置一张6×6mm盖玻片的12孔细胞培养板中,40%融合后将50nM siRNAHIF-1α转染入Tca8113细胞,24h后置入乏氧培养箱培养24h。免疫荧光检测siRNAHIF-1α转染后乏氧培养条件下HIF-1α蛋白表达的情况。4.MTT方法检测siRNHIF-1α对Tca8113细胞增殖的影响:取指数生长期细胞消化计数后按6×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,约40%融合后转染siRNAHIF-1α。常氧或乏氧培养24、48、72h后,MTT方法检测siRNAHIF-1α对细胞增殖的影响。5.流式细胞仪检测siRNAHIF-1α对细胞凋亡率的影响:取指数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,约40%融合后转染50nMsiRNAHIF-1α,乏氧培养24h后收集细胞,Annexin V/PI双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。6.CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒检测siRNAHIF-1α对Tca8113细胞黏附能力的影响:经转染处理的Tca8113细胞常氧或乏氧培养24h,收集细胞,取细胞悬液100μl（1×105个细胞）加入CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒中各孔,用490nm波长测定每孔的光吸收值（A）。7.细胞侵袭分析试剂盒检测siRNAHIF-1α对Tca8113细胞侵袭能力的影响:取转染后的Tca8113细胞悬液300μl（3×105个细胞）加入细胞侵袭分析试剂盒的Boyden小室的上室,在下室加入500μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,常氧或乏氧培养24h。光镜下计数侵袭到滤膜背面的穿膜细胞数,评价细胞的侵袭能力。8.real-time PCR方法检测siRNAHIF-1α转染对ADM表达的影响:转染后的Tca8113细胞常氧或乏氧培养24h,real-time PCR方法检测ADM在mRNA水平的表达情况。结果1.siRNAHIF-1α可以有效沉默Tca8113细胞HIF-1α基因:siRNA转染后常氧或乏氧培养24h,干扰组Tca8113细胞HIF-1αm RNA的表达均较对照组显著下调,蛋白含量亦显著降低。2.沉默HIF-1α抑制Tca8113细胞的增殖:转染siRNAHIF-1α的Tca8113细胞乏氧培养24h后,增殖较对照组明显抑制（0.252±0.029 vs 0.322±0.031,P＜0.05）,而常氧培养条件下增殖无明显抑制。转染48h或72h后无论在常氧或乏氧条件下Tca8113细胞增殖均显著抑制（P＜0.01）。3.沉默HIF-1α诱导Tca8113细胞的凋亡:siRNAHIF-1α转染的Tca8113细胞常氧或乏氧培养24h,凋亡细胞与对照组相比显著增加（（12.15±1.02）%vs（4.68±0.56）%,（17.77±1.22）%vs（6.43±0.55）%,P＜0.01）。4.沉默HIF-1α抑制Tca8113细胞的黏附和侵袭能力:Tca8113细胞转染siRNAHIF-1α后常氧或乏氧培养24h,细胞黏附能力下降至对照组的74%和63.6%,细胞侵袭能力下降至对照组的65%和55.8%。5.沉默HIF-1α抑制乏氧诱导的ADM mRNA的表达:Tca8113细胞转染siRNAHIF-1α后乏氧培养24h,ADM mRNA的表达较对照组无明显增加（（0.04±0008）vs（0.37±0.04）.P＞0.05）。结论1.siRNAHIF-1α介导的HIF-1α沉默能够引起Tca8113细胞凋亡率增加,从而抑制细胞的增殖,并能抑制Tca8113细胞的黏附和侵袭能力,提示HIF-1α在Tca8113细胞生物学行为的调节中可能起关键作用。2.本研究首次证实沉默Tca8113细胞HIF-1α能抑制下游ADM基因的表达,提示HIF-1α可能通过调控ADM基因的表达参与其生物学行为及乏氧适应的调节。3.HIF-1α/ADM通路对Tca8113细胞乏氧适应调节机制的揭示,对制订基于乏氧设计策略的舌癌生物治疗疗法提供新的思路和新靶点。