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蔷薇科植物种类繁多,很多都具有经济价值和观赏价值。通过各种技术调节花期,使植物在预定的时间开花,就可以达到更高的观赏价值和应用价值。本研究通过分子手段,成功克隆了蔷薇科7个物种的TFLJ基因和SOC1基因,并对它们的表达情况进行分析,构建了超量表达载体。主要实验结果如下:
1.通过同源克隆,结合TAIL-PCR技术,成功克隆了梅花(Prunus mume)中TFL1的同源基因PmTFL1基因、月季(Rosa hybrida)中TFL1的同源基因RhTFL1基因、草莓(Fragaria ananassa)中TFL1的同源基因FaTFL1、石楠(Photinia serrulata)中TFL1的同源基因PsTFL1、绣线菊(Spiraea cantoniensis)中TFL1的同源基因ScTFL1、火棘(Pyracantha fortuneana)中TFL1的同源基因PfTFL1、日本晚樱(Pruniisyedoensis)中TFL1的同源基因PyTFL1。同时也克隆了6个物种中的SOC1的同源基因,分别为:梅花PmSOC1基因、月季RhSOC1基因、草莓FaSOC1基因、石楠PsSOC1基因、绣线菊ScSOC1基因、日本晚樱PySOC1基因。
2.对获得的蔷薇科7个物种中的TFL1同源基因进行氨基酸预测,并与其他物种进行比对分析,发现这7个TFL1基因的结构高度保守,均有4个外显子和3个内含子,两个关键位点His88和Asp144均很保守。系统进化树分析结果显示,TFL1蛋白被分为2个亚类,一类是CEN-like,另一类是TFL1-like。其中月季的RhTFL1属于CEN-like类:而其他6个物种的TFL1蛋白都属于TFL1-like类,与其他蔷薇科植物的TFL1聚为一类。对获得的蔷薇科6个物种的SOC1同源基因进行氨基酸预测,并与其他物种进行同源比对分析,发现SOC1基因具有典型MIKC类的MADS-box基因家族结构特征,即高度保守的MADS区、相对不保守的I区、较为保守的K区、多变的C区。克隆到的6个SOC1基因都有7个外显子,最后一个外显子处存在一段非常保守的序列DVETQLFIGP。进化分析显示,整个蔷薇科植物的SOC1蛋白聚为一类。
3.构建了5个TFL1同源基因的超量表达载体。用月季的cDNA构建了pCAMBIA2300s-RhTFL1c载体。分别用梅花的cDNA和gDNA构建了PMV-PmTFL1c载体和PMV-PmTFL1g载体,分别用草莓的cDNA和gDNA构建了PMV-FaTFL1c载体和PMV-FaTFL1g载体。分别构建了梅花、月季和草莓的SOC1同源基因超量表达载体PMV-PmSOC1c、PMV-RhSOC1c和PMV-FaSOC1c共3个载体。并将以上8个超量表达载体转入农杆菌EHA105中。
4.利用半定量RT-PCR对梅花、月季和草莓中的TFL1基因和SOC1基因的表达部位和强度进行了分析。TFL1基因是花序分生组织特异表达的基因,主要在茎顶端的分生组织中表达。在植物的营养生长阶段TFL1基因处在低水平表达阶段,从而延长植物的营养生长；而在花序分生组织中,TFL1基因处在高水平表达阶段,尤其在顶芽中表达量高,并从4月底到8月底表达量由高到低逐渐下降,从而会维持花序的无限生长,抑制植物开花。SOC1基因表达的部位更为广泛,在营养器官和花器官中均有表达,在营养器官中表达量高,而在成熟花中表达量很微弱。