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以中国对虾“黄海1号”第12世代人工选育群体为试验材料,结合正交设计法,构建了中国对虾序列相关扩增多态性( Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP)分子标记技术体系,并以此为技术平台,结合分群分析法(BSA)进行了中国对虾抗高氨氮和高pH性状相关分子标记的筛选和克隆研究。具体研究内容和结果如下:
利用正交设计L16(45)对影响中国对虾SRAP分子标记分析的5个因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP和引物浓度)在4个水平上进行了优化,筛选出各反应因素的最佳反应水平为:20μL反应体系中包含1.0UTaq酶,2.0mmol/L的Mg2+,40.0ng的模板DNA,0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物,引物的退火温度为53.5℃。研究表明各因素的不同水平对扩增结果有显著影响,其中Mg2+影响最大,影响大小顺序依次为Mg2+,Taq酶,引物,dNTP和模板DNA。利用优化的SRAP分子标记体系对中国对虾“黄海1号”第12世代人工选育群体进行了遗传多样性分析的应用,实验结果表明此标记技术可作为中国对虾遗传分析的良好技术工具。遗传多样性分析中共筛选出8对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合,共获得171个位点;其中多态性位点154个,占90.08%;有效等位基因数为1.7741,期望杂合度均值为0.4219,shannon多样性指数为0.6055。上述参数值均高于应用AFLP技术对前几代选育群体的遗传多样性分析结果。
采用SRAP分子标记技术,结合BSA法对中国对虾“黄海1号”高氨氮敏感组和耐受组进行分析,筛选出与高氨氮耐受性相关的遗传标记,以期为进一步的基因定位及种质资源保护提供技术支持和理论参考。本研究应用了110对SRAP引物筛选出77对引物进行群体验证分析,共获得1155个标记。根据标记在群体中出现频率和变化规律,筛选出6个可能与高氨氮耐受性相关的分子遗传标记,占标记总数的0.52%,其中敏感性负相关标记1个,耐受性正相关标记5个。对获得的6个分子标记进行回收,连接于pMd-18T载体后转化于大肠杆菌TOP10感受态细胞,进行了克隆和测序。将测序结果进行了BLAST分析比对,发现测得片段序列与数据库中序列同源性较低(<15%),未找到与之同源性较高的功能基因。这与利用RAPD和AFLP技术筛选中国对虾生长和抗病标记研究结果类似。推论这些特异性标记可能与高氨氮耐受性性状密切相关,下一步进行大规模的群体相关性研究进行验证。
以经高pH胁迫处理区分出的中国对虾敏感组和耐受组为材料,采用SRAP分子标记技术和BSA法筛选出与高pH耐受性相关的遗传标记。110对SRAP引物经筛选获得在BSA基因池产生差异的引物102对,用于群体验证分析。根据标记在群体中出现频率和变化规律,筛选出7个可能与高pH耐受性相关的分子遗传标记,其中耐受高pH负相关标记2个,正相关标记5个。对获得的7个分子标记进行回收,克隆和测序。将测序结果进行了BLAST分析比对,M2E2-2引物扩增出的片段序列与中国对虾Toll样受体序列同源性为99%,而其他测得片段序列与数据库中序列同源性较低(<15%),未找到与之同源性较高的功能基因。根据测序结果,设计了7对引物,进行SCAR标记转化。其中一个标记转化成功,在耐受组出现频率为54.2%,而在敏感组出现频率为零,此标记可作为中国对虾抗高pH性状选择的候选遗传标记。