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日本脑炎病毒(Japanesesencephalitisvirus，JEV)属黄病毒家族，为流行性乙型脑炎（乙脑）病原体。JEV感染往往引起严重的中枢神经系统的损害，幸存者留有程度不同的神经系统后遗症，给社会、家庭和个人带来沉重的负担。乙脑尚无有效的治疗手段，因此免疫接种是控制其流行、保护易感人群的重要措施，目前使用的JEV疫苗主要是几种灭活疫苗和SA14-14-2减毒活疫苗。虽然疫苗的使用显著降低了乙脑的发病率，但上述疫苗均存在一定局限性，因此亟待发展一种安全、有效、质优价廉、制备简便的新型JEV疫苗，而DNA疫苗的出现则成为当前新型JEV疫苗的重要策略之一。 但是单纯的DNA疫苗尚不足以引发良好的免疫效果，需要借助于佐剂，尤其是近年广泛使用的细胞因子佐剂，可上调机体免疫水平，进而增强核酸疫苗的免疫效果。其中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，GM-CSF）因具有可促进抗原呈递细胞(antigen-presentingcell，APC)的趋化及树突状细胞(dendriticcell，DC)的成熟和活化、进而提高免疫系统的抗原提呈能力、增加疫苗的免疫原性等优点而得到广泛关注，目前GM-CSF已被证实是良好的基因佐剂。同时，GM-CSF也是一种具有多项潜能的造血生长因子，可促进造血干细胞增殖、分化和成熟等，并且可以活化免疫细胞，诱导体液免疫和细胞免疫，提升自然免疫中效应细胞的杀伤能力，目前临床上主要作为骨髓激动剂用于调节骨髓造血功能以及机体免疫等。 然而，本实验室在前期的疫苗研究工作中发现，GM-CSF质粒与JEVprM-E-NS1DNA疫苗共同接种不仅没有增强、反而明显抑制了疫苗诱导的免疫应答。因此，本研究以JEVprM-E的真核表达质粒作为候选DNA疫苗，以小鼠GM-CSF的真核表达质粒作为佐剂进行免疫共接种，以评价GM-CSF在JEVprM-EDNA疫苗诱导的免疫应答中的作用，并初步阐明GM-CSF免疫抑制作用的特点及其可能机制，为实验室研究和临床安全、合理使用GM-CSF提供重要信息。 主要的实验流程与结果如下: 一.共接种条件下，GM-CSF抑制了JEVprM-EDNA候选疫苗诱导的体液免疫应答反应 1.动物免疫 将6周龄雌性BALB/c小鼠分为疫苗组、疫苗佐剂组及对照组。其中，疫苗组小鼠接种JEVprM-EDNA疫苗以及空载体pCAGGSP7，疫苗佐剂组小鼠共接种JEVprM-EDNA疫苗以及GM-CSF质粒，对照组接种pCAGGSP7。免疫方法为双侧股四头肌注射，剂量为100μg/次/只，间隔3周，共免疫三次。 2.ELISA检测抗体水平的动态变化 每次免疫前以及末次免疫后，取血分离血清，ELISA检测JEV特异性抗体的产生情况。疫苗组在第一次免疫后3周即可检测到明显的抗体反应，并且随第二、三次加强免疫而进一步升高，说明JEVprM-EDNA疫苗具有良好的免疫原性;然而，疫苗佐剂组在初次免疫后未检测到明显的抗体反应，经过两次加强免疫后，其水平虽有一定程度的提高，也远低于疫苗组，这一结果说明该组针对病毒抗原的免疫应答受到了抑制。 3.ELISA测定终点抗体效价 ELISA测定末次免疫后3周各组小鼠血清特异性抗体的效价。疫苗组小鼠产生高水平的抗JEVIgG抗体，平均几何滴度为1∶14700;然而疫苗佐剂组的抗体滴度仅为1∶1838，两者具有十分显著的差异，表明GM-CSF佐剂在共接种条件下抑制了机体针对JEVprM-E抗原的特异性免疫应答反应。 4.ELISA检测抗体IgG亚型 ELISA检测末次免疫后3周各组免疫血清抗体的IgG亚型。相对于对照组，疫苗组及疫苗佐剂组的IgG1和IgG2a亚型水平都有较大幅度的升高，两组的IgG2a/IgG1比值分别为0.613±0.045和0.734±0.057，提示JEVprM-E诱导的免疫应答反应具有Th2倾向性。同时两组之间的IgG2a/IgG1比值没有明显的统计学差异，提示共接种GM-CSF对于JEV疫苗的Th2反应的倾向性无明显的影响。 5.间接免疫荧光染色检测抗体水平 间接免疫荧光染色检测末次免疫后3周各组免疫血清的抗体水平，空载体对照组仅观察到极低的非特异性背景荧光，疫苗组则产生明显的特异性荧光，荧光强度与阳性对照相当，而疫苗佐剂组则显示了较低的荧光强度，说明JEVprM-E质粒免疫后获得的抗血清能够特异性识别自然状态下感染的JEV病毒抗原，但抗体水平可被GM-CSF所抑制。 6.动物保护实验 末次免疫后3周，对小鼠进行攻毒实验，腹腔注射50LD50JEVBeijing-1病毒株，在21天观察期内，对照组小鼠全部死亡，疫苗组、疫苗佐剂组小鼠生存率分别为100％、50％，说明JEVprM-EDNA候选疫苗可诱导机体产生有效的保护性免疫，而共接种GM-CSF可抑制这一保护作用。 综上所述，第一部分结果表明GM-CSF在共接种条件下，抑制了JEVprM-EDNA疫苗诱导的免疫应答反应和免疫保护作用。为此在后续研究中，我们探讨了这种免疫抑制作用的特点和可能机制。 二.GM-CSF的免疫抑制作用与其剂量及作用时间呈现依赖关系，并与共接种的免疫原相关 1.ELISA检测GM-CSF表达水平 BALB/c小鼠分别接种10、25、50μg的GM-CSF质粒，1天后即可检测到血清GM-CSF，至第5天表达量达到最高峰，三个剂量组GM-CSF最高表达水平依次为46.46±5.88、67.36±11.81以及105.84±14.58pg/ml。说明GM-CSF质粒接种小鼠后可以正确表达，并且表达量梯度与质粒接种剂量梯度相关。 2.ELISA检测剂量关系组抗体水平 将10、25或50μg剂量的GM-CSF质粒分别与50μg的JEVprM-E质粒共同免疫小鼠，三次免疫后抗JEV抗体的几何平均效价分别为1∶6400、1∶2285和1∶1838，远低于疫苗组的效价，且剂量越高抑制作用越显著，说明GM-CSF对JEVprM-EDNA疫苗诱生的免疫抑制作用有明显剂量依赖关系。 三个剂量组的IgG2a/IgG1比值依次为0.765±0.055、0.554±0.041和0.613±0.045，与疫苗组相比并没有明显的统计学差异。说明GM-CSF的不同剂量对JEVprM-EDNA疫苗诱生的Th2亚型为主的免疫反应倾向性没有明显的影响。 3.ELISA检测时间关系组抗体水平 50μg的GM-CSF质粒分别提早3天、1天、同时或滞后1天与50μgprM-EDNA疫苗共同免疫小鼠，三次免疫后抗JEV抗体的几何平均效价分别为1∶1213，1∶1393，1∶1838以及1∶4222，均远低于疫苗组，其中，提早或同时予以GM-CSF处理诱导的免疫抑制作用更强，表明GM-CSF质粒对JEVprM-EDNA疫苗诱生免疫反应的抑制作用具有时间依赖关系。 四个时间组的IgG2a/IgG1比值依次为1.509±0.141、1.094±0.099、0.613±0.045和0.662±0.065，说明提前3天接种GM-CSF质粒的免疫反应以Th1型为主;提前1天接种则诱导产生Th1/Th2混合型免疫应答;当GM-CSF质粒与疫苗同时或滞后接种时，表现为Th2型免疫反应的增强。结果提示，GM-CSF与DNA疫苗接种的时间可显著影响Th免疫反应的类型，GM-CSF的预处理可使免疫反应更偏向于Th1型。 4.ELISA检测免疫原关系组抗体水平 GM-CSF质粒分别与黄病毒家族中的登革病毒(Denguevirus，DENV)1、2型的prM-EDNA疫苗或者丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)的C、E1DNA疫苗共接种免疫小鼠，三次免疫后DENV1和2型的prM-EDNA疫苗的抗体平均效价均为1∶3200，而加入GM-CSF后的效价分别降低为1∶1600和1∶2111，提示GM-CSF抑制DENV1和2型prM-EDNA诱导的免疫应答反应;HCV的C和E1DNA疫苗免疫小鼠后的抗体平均效价为1∶460和1∶606，与GM-CSF共接种后的效价略升高为1∶527和1∶857，GM-CSF则显示了一定的免疫促进趋势。 以上结果说明GM-CSF对DNA疫苗诱生的免疫应答反应的影响与其共接种免疫原有密切关系，至少在所研究的黄病毒家族的几个成员中，GM-CSF的作用呈现了复杂的多样性。 三.GM-CSF诱导的免疫抑制的作用机制与未成熟的“耐受型”DC的诱生以及调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)的扩增有关 1.DNA免疫小鼠血清中JEVprM-E表达水平 ELISA检测小鼠DNA接种前及免疫后21天内血清中的JEVprM-E蛋白表达水平。接种后3天，两组的prM-E蛋白表达量均有明显升高，表达高峰出现在DNA免疫后5天，接种后14天血清中仍可检出prM-E。疫苗组与疫苗佐剂组之间prM-E的血清水平无明显差异，说明GM-CSF质粒对于JEVprM-E抗原在小鼠体内的表达没有显著影响。 2.共接种GM-CSF对细胞因子水平的影响 DNA免疫三次后，分离小鼠脾细胞，以JEV全蛋白为抗原进行刺激，利用ELISpot检测脾细胞分泌的细胞因子水平，疫苗组的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-17水平均明显高于pCAGGSP7对照组，疫苗佐剂组IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-17分泌量均显著低于疫苗组，但抑制性细胞因子IL-10的水平则明显高于疫苗组。结果表明，肌肉注射JEVprM-EDNA疫苗可刺激机体产生Th1、Th2、Th17亚型免疫反应，但这三种亚群均可被GM-CSF所抑制。IL-10水平的上调提示GM-CSF的免疫抑制作用可能与DC的成熟度和/或Treg的产生相关。 3.共接种的GM-CSF对DC成熟度的影响 DNA免疫小鼠三次后，FACS双标法检测小鼠外周血中成熟DC表面的分子标志CD11c、CD40、CDS0、CD86和MHCⅡ。结果显示，疫苗组和对照组DC表面的成熟标记分子表达水平没有明显差异，但疫苗佐剂组小鼠DC成熟标记的表达水平明显下调，说明JEVprM-EDNA疫苗并没有促进DC的成熟，同时，共接种的GM-CSF显著抑制了DC的成熟过程。 4.共接种的GM-CSF对Treg的影响 DNA免疫小鼠三次后，FACS四标法检测小鼠外周血中Treg细胞特异性表面标记CD3e、CD4和CD25以及胞内标记Foxp3，相对于疫苗组，疫苗佐剂组CD3e+CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的百分数有显著的上升。这一结果与FACS对DC成熟度的检测结果相符，说明DC表面共刺激分子表达水平的下调可能诱导了Treg细胞的产生，下调效应性T细胞的反应性，从而出现免疫抑制效应。 综合以上研究结果，我们认为:(1)共接种的GM-CSF显著抑制了JEVprM-EDNA疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答;(2)GM-CSF的免疫抑制作用呈现剂量依赖及时间依赖关系，并与共接种的免疫原相关;(3)GM-CSF没有改变JEVprM-E免疫原的表达水平，其免疫抑制作用伴随着IL-10水平的上调、未成熟的“耐受型”DC的诱生以及Treg的扩增，但本实验未发现骨髓源性抑制性细胞(Myeloid-derivedsuppressorcell，MDSC)对免疫抑制过程的影响。(4)结合分析不同的研究报告中GM-CSF、IL-12等对JEVDNA疫苗的抑制作用，提示JEV免疫原的特殊性尚有待于深入阐明;另外也提示GM-CSF作为疫苗佐剂具有局限性，特别是对于JEV疫苗，细胞因子佐剂的适用性值得进一步探讨。本研究结果不仅对进一步了解GM-CSF作用的复杂性和功能的多样性提供了重要的实验数据，同时也为GM-CSF的临床安全应用提供了参考信息。特别是对于利用GM-CSF作用的双相性，在疫苗佐剂研究中挖掘其免疫增强作用，在临床应用中开发其免疫抑制价值（例如用于自身免疫性疾病的治疗）、优化其免疫调节功能等，具有一定的借鉴意义。