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骨钙素(Osteocalcin，OC)又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由成熟成骨细胞合成和分泌的一种特异的非胶原骨基质蛋白。OC在体内以羧化不全骨钙素(Undercarboxylated Osteocalcin，ucOC)和羧化骨钙素(Carboxylated Osteocalcin，cOC)两种形式存在，三个谷氨酸残基都被羧化的骨钙素称为羧化骨钙素，含有未羧化谷氨酸残基的骨钙素称为羧化不全骨钙素，其中包含三个谷氨酸残基都未被羧化的骨钙素，即未羧化骨钙素(Uncarboxylated Osteocalcin，unOC)。最新研究发现，unOC参与能量代谢，并维持体内血糖的平衡。实验室前期研究发现高糖能抑制成骨细胞的增殖、分化及矿化。然而，unOC能否调节高糖环境下成骨细胞的增殖和分化目前还不清楚。因此，我们通过原核表达并分离纯化获得小鼠的骨钙素蛋白，处理高糖环境下的成骨细胞，研究unOC对高糖环境下成骨细胞(MC3T3-E1)增殖和分化的影响及分子机制。 研究发现，高糖能引起活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)含量上升，抑制成骨细胞的增殖和分化，而unOC能降低活性氧的含量并促进高糖环境下成骨细胞的增殖和分化。我们用未羧化骨钙素处理高糖环境下的MC3T3-E1细胞，利用CCK-8检测细胞增殖，荧光探针法测定胞内ROS含量，茜素红染色观察钙化结节的形成，油红染色定量分析脂滴的形成，ELISA检测成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白(TypeⅠ Collagen)的表达量，酶标法检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)的活性。用实时定量PCR检测成骨分化相关基因的表达，包括Runx2，osterix，osteocalcin，和成脂分化相关基因的表达，包括PPARγ，aP2和FAS。结果显示:unOC促进高糖环境下成骨细胞的增殖和分化;unOC和NAC（ROS清除剂—N-乙酰半胱氨酸，N-acetyl-cysteine，NAC）均能缓解高浓度葡萄糖对成骨细胞分化的影响，促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达、成骨分化相关基因的表达及钙化结节的形成，而抑制ALP活性、成脂相关基因的表达及脂滴的形成。由此得出结论:unOC通过降低高糖引起的ROS水平，促进成骨细胞向成骨方向分化，抑制其向成脂方向分化。 进一步探索unOC对高糖环境下成骨细胞分化影响的分子机制，用未羧化骨钙素处理高糖环境下MC3T3-E1细胞，同时设置加入PI3K特异性磷酸化抑制剂LY294002的对照组，分别于实验不同时段检测成骨和成脂分化相关指标，western-blot检测PI3K的磷酸化水平。实验结果显示:unOC和NAC能降低ROS激活的PI3K/Akt的磷酸化水平，促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白和成骨分化相关基因的表达，抑制ALP活性和成脂分化相关基因的表达。 总之，我们的实验结果表明，unOC通过降低高糖引起的氧化应激，阻断ROS激活的PI3K/Akt信号通路，促进成骨细胞的成骨功能，而抑制其向成脂方向的分化。该研究为治疗糖尿病性骨质疏松提供了潜在的药物靶点。