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研究背景宫颈癌是全球女性癌症中仅次于乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌的第四位恶性肿瘤,根据报道2020年全球女性子宫颈癌新发病例604127例,死亡病例341831例,分别占女性癌症发病和死亡总数的6.5%和7.7%。而宫颈癌在发展中国家的发病率和死亡率均远高于发达国家,发病率分别为18.8/10万和12.4/10万,死亡率分别为11.3/10万和5.2/10万。根据国际癌症研究机构（IARC）估计,到2030年,每年将新增加约71万的宫颈癌患者,约有38万的女性将因子宫颈癌死亡。子宫颈鳞状上皮内病变（Cervical squamous intraepithelial lesion,SIL）或宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）是与宫颈浸润癌密切相关的一组癌前病变,积极治疗宫颈上皮内瘤变预防宫颈癌已得到广泛认可。现已证实宫颈癌和宫颈鳞状上皮内病变的发生主要与高危型HPV持续感染有关,但在疾病的发生、发展过程中如何影响机体免疫细胞的调节过程还不清楚。有研究发现约13.8-16.5%活检病理确诊的CIN2-3的患者在子宫颈锥切术后病理未发现子宫颈上皮内病变,除外高级别上皮内病变的病灶较小这方面原因,也可能与子宫颈活检术后导致局部炎症反应、诱发病变自然消退或免疫系统介导消除病变有关。尽管HPV疫苗和宫颈癌筛查的项目已经在中国开展,但是由于我国人口众多,卫生资源分布不均,仍有部分患者在初始治疗后复发、转移,部分患者在诊断时已为晚期。目前,对于复发、转移或晚期宫颈癌患者,化疗和放疗的效果不满意,而免疫治疗是继手术、化疗、放疗、靶向治疗后的一种新的治疗手段。近年来,靶向程序性死亡受体（Programmed death-1,PD-1）的治疗引起了广泛的关注。PD-1是一种共抑制细胞表面受体,主要在B细胞和T细胞中表达,当被其配体（PD-1 ligand,PD-L1）激活时,可抑制T细胞介导的免疫反应。早期临床试验显示,PD-1抗体具有持久的抗肿瘤免疫反应的结果,因此,多种靶向PD-1/PD-L1单克隆抗体被批准用于治疗各种癌症类型中,包括宫颈癌。PD-1抑制剂派姆单抗被批准用于PD-L1阳性的复发或转移性宫颈癌的二线治疗。然而,从Keynote-028和Keynote-158临床研究的结果看,派姆单抗在PD-L1阳性宫颈癌中的客观缓解率不足20%。由此可见,阻断单一免疫检查点的疗效并不理想。因此,需要寻找抗PD-1免疫治疗耐药的机制,为宫颈癌患者,尤其是PD-L1阴性患者,寻找新的治疗靶点和策略,提高免疫治疗的疗效。PD-L1也被称为B7-H1,属于B7家族成员。目前B7家族包括10个成员,如 PD-L1、PD-L2、B7-H3（B7 homolog 3）和 B7-H4（B7 homolog4）。B7-H3,又称为CD276,是一种Ⅰ型膜蛋白,与B7家族其他成员具有高度的同源性。B7-H3在多种肿瘤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和肿瘤血管内皮细胞中表达异常高。B7-H3既可以刺激T细胞的活化,又可以抑制T细胞的功能。由于B7-H3参与肿瘤免疫、化疗耐药、肿瘤的转移等,目前,已经有正在进行的靶向B7-H3的临床研究。B7-H3在宫颈癌中高表达,能促进肿瘤细胞的增殖、迁移,增加肿瘤浸润转移性,是预后不良的独立预测因子。尽管B7-H3在宫颈癌中的表达在以往研究中被报道。但其与PD-L1的相关性尚不清楚。此外,既往研究中纳入的患者数量较少,尤其是腺癌患者。因此,B7-H3与组织学类型以及与生存结果之间的关系尚不清楚。B7-H4,B7超家族中的另一个Ⅰ型膜蛋白,于2003年首次发现,具有免疫抑制的作用。尽管B7-H4在正常组织中表达受限,但它在多种肿瘤中均有高表达,且具有高度的肿瘤特异性。许多研究都表明B7-H4的表达上调与癌肿预后密切相关。通过对PD-1和B7-H4的阻断,可使体外细胞株具有协同抗肿瘤作用,提示阻断B7-H4途径可提高已有抗PD-1抗体的疗效。然而,B7-H4在宫颈癌中的表达、与PD-L1的关系及预后的关系尚不明确。本项目课题的目的是探讨免疫检查点B7-H4及T细胞亚群与锥切术后阴性的相关性,试图寻找一种确切的方法预测锥切术后病理阴性,以避免不必要的治疗和可能导致的宫颈狭窄、宫颈机能不全、早产等远期并发症。同时探索免疫检查点B7-H3和B7-H4在宫颈癌及癌前病变中的表达、与宫颈癌临床病理特征、PD-L1及预后的关系;并进一步在宫颈癌小鼠模型中,观察联合阻断B7-H3和PD-1的抗肿瘤效果是否发挥协同作用,提高抗PD-1免疫治疗的疗效,为宫颈癌的免疫治疗新策略提供依据。第一部分 宫颈高度上皮内病变锥切术后病理阴性的相关因素分析目的:经活检确诊的子宫颈鳞状上皮内病变行子宫颈锥切术后病理阴性的相关临床因素分析,并探讨免疫检查点B7-H4及T细胞亚群与锥切术后阴性的相关性。方法:收集2005年7月至2013年12月因子宫颈高级别鳞状上皮内病变在山东大学齐鲁医院行宫颈锥切术的807例患者的临床资料,进行回顾性分析,数据从阴道镜计算机数据库和医院患者数据库中提取,包括患者年龄、是否绝经、锥切深度、活检组织学分级、锥切标本的组织学分级及切缘状态、腺体受累情况等;将锥切术后病理诊断无上皮内病变的患者视为锥切术后病理阴性。应用倾向性评分系统,筛选出75例锥切术后阴性患者作为实验组,75例锥切术后病理证实的HSIL患者作为对照组。匹配的9个因素分别为患者年龄、是否绝经、液基细胞学检查（TCT）、活检病理诊断、HPV感染、切缘状态、腺体受累、阴道镜评估是否充分和子宫颈锥形切除术方式等。调取这75对患者的活检及锥切术后组织的石蜡标本,应用免疫组化和免疫荧光染色检测方法检测活检病理诊断SIL患者的B7-H4、调节性T细胞（CD4+Foxp3+）、CD4+T细胞、CD8+T细胞和干扰素-γ的表达差异;32例慢性子宫颈炎和CIN1标本作为对照。分类资料数据分析采用卡方检验或Fisher确切概率法。采用多变量logistic回归模型确定独立预后因素;计算风险比（HRS）作为风险指标。结果:收集在活检诊断后初次接受子宫颈锥切术的807例患者;年龄范围21-62岁,平均年龄38.8±8.0岁。807例锥切标本中,104例（12.9%）锥切术后病理提示无上皮内病变,其中20.8%CIN2及8.3%CIN3患者锥切术后病理提示无上皮内病变。绝经、非16,18其他高危型HPV病毒感染、阴道镜检查不充分、活检标本中未见腺体累及、锥切深度≤18mm与锥切术后病理组织中无上皮内病变显著相关。本组资料提示子宫颈活组织检查术确诊CIN2的患者,TCT提示未见上皮内病变及癌细胞（NILM）、不典型鳞状细胞（ASC）或低级别鳞状上皮内病变（LSIL）以及接受LEEP治疗的患者,其锥切术后病理标本上有病变的可能性较小。logistic多因素回归分析显示,活检病理诊断为CIN2是锥切术后病理阴性的独立预测因素。B7-H4在CIN2和CIN3中阳性表达率分别为11.1%和46.7%,而在CIN1和慢性子宫颈炎中无表达。B7-H4在锥切术后病理阴性组的活检标本中阳性表达率为17.3%（13/75）,在锥切术后病理阳性组的活检标本中阳性率为38.7%（29/75）,显著高于锥切阴性组;差异有统计学意义（P＜0.001）。B7-H4阴性组的CD8+T细胞、INF-γ和INF-γ+CD8+T细胞的数量显著高于B7-H4阳性组。然而,B7-H4阳性组的Treg细胞（CD4+Foxp3+）数量明显高于B7-H4阴性组。CD4+T细胞数在两组之间没有显著差异。这些数据表明,B7-H4与肿瘤微环境中的抑制信号有关。结论:CIN2患者锥切术后病理阴性比率升高;B7-H4抑制T细胞功能和宫颈局部的抗肿瘤免疫应答,B7-H4阴性表达与子宫颈锥切术后病理阴性有相关性,对于上述患者应慎重选择手术治疗方案。第二部分 B7-H 3和B7-H4在子宫颈癌中的表达及临床意义目的:研究B7-H3和B7-H4在宫颈癌中的表达模式,并确定其与PD-L1、临床病理特征及宫颈癌患者预后的相关性。方法:收集自2012年1月至2015年12月在山东大学齐鲁医院诊治的宫颈鳞癌患者（N=406）和自2008年1月至2017年12月诊治的普通型子宫腺癌（N=146）。临床病理资料包括:确诊时年龄、肿瘤组织学类型、分化程度、肿瘤浸润深度、宫旁浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移情况、术后辅助治疗（化疗、放化疗或放疗）、复发和死亡情况。利用552例宫颈癌术后的石蜡标本,制作组织芯片,采用免疫组化方法检测组织中B7-H4、B7-H3和PD-L1的表达情况。使用卡方检验来确定分类变量之间的关联,用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并用log-rank检验进行比较。结果:B7-H3在肿瘤细胞中表达阳性率为32.1%,在间质细胞中表达阳性率为92.9%,在间质细胞中主要表达在成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞。在21%的样本中B7-H3与PD-L1共表达,而41.7%的样本中只有一种或另一种表达。B7-H3在鳞状细胞癌中阳性表达率为36.0%,明显高于腺癌中21.2%的阳性率（P=0.001）。伴有淋巴结转移患者B7-H3的阳性率为40.5%,明显高于无淋巴结转移患者的29.9%（P=0.032）。与PD-L1阴性组相比（22.8%）,在PD-L1阳性组B7-H3的阳性表达率更高（40.7%）,表明B7-H3与PD-L1的表达呈正相关。PD-L1在鳞状细胞癌中的阳性率（58.4%）高于在腺癌中的阳性率（32.9%）（P＜0.001）;在低分化肿瘤中的阳性率（43.5%）高于高中分化肿瘤（55.7%）（P=0.007）。与B7-H3和PD-L1的表达模式不同,B7-H4仅在肿瘤细胞中表达,在间质细胞中未检测到B7-H4的表达。252例（45.6%）表现为B7-H4阳性。B7-H4在宫颈鳞癌中的阳性率（52.0%）显著高于宫颈腺癌中的阳性率（28.1%）（P＜0.001）。B7-H4 与 B7-H3 的表达正相关,B7-H4 在 B7-H3阳性的标本中的阳性率（54.2%）显著高于B7-H3阴性标本中（41.6%）的阳性率（P=0.005）。B7-H4的表达与PD-L1的表达无显著相关。在整个研究队列中,B7-H4的表达与患者的预后无关。在PD-L1阴性的亚组中,B7-H4阳性患者的预后比B7-H4阴性患者的无进展生存期更长,HR为0.36,95%可信区间为（0.17-0.77）。在单因素生存分析中,肿瘤细胞中B7-H3阳性、FIGO ⅡA1期、宫旁浸润、深间质浸润（≥1/2）和淋巴结转移患者的无复发生存期（RFS）和总体生存期（OS）更短。在多变量分析中,肿瘤细胞中B7-H3阳性是较短RFS（HR 2.1,95%CI 1.2-3.6,P=0.006）和 OS（HR 1.8,95%CI 1.1-3.0,P=0.023）的独立预测因子。B7-H3在宫颈腺癌Silva分型中的分布:A型中阳性率为0,B型中的阳性率为17.1%,C型中的阳性率为27.9%。B7-H3在C型中的阳性率最高,三组之间有显著差异（P=0.020）。与B7-H3阴性患者相比,B7-H3阳性的宫颈腺癌患者的RFS（P=0.012）及OS（P=0.007）更低。结论:B7-H3的表达是宫颈鳞癌及腺癌患者不良预后的独立预测因子。B7-H3与PD-L1的表达呈正相关,联合阻断B7-H3和PD-1/PD-L1有望成为宫颈癌免疫治疗的新策略。在PD-L1阴性的患者中,B7-H4阳性患者的预后明显优于B7-H4阴性患者,因此,B7-H4可能是PD-L1阴性宫颈癌患者的预后因子和潜在治疗靶点。第三部分 联合阻断B7-H3和PD-1在宫颈癌动物模型中的疗效目的:在宫颈癌小鼠模型中,观察联合阻断B7-H3和PD-1的抗肿瘤效果是否发挥协同作用,能否提高抗PD-1免疫治疗的疗效。方法:在免疫功能正常的小鼠体内建立宫颈癌移植瘤模型,分别给予联合阻断B7-H3和PD-1治疗、阻断B7-H3治疗、阻断PD-1治疗和同型抗体对照,测量并比较各组小鼠肿瘤的生长情况及肿瘤体积。结果:阻断B7-H3治疗组和阻断PD-1治疗组肿瘤体积均小于同型对照组（P均＜0.01）,联合阻断B7-H3和PD-1组的肿瘤体积小于单独阻断B7-H3（P＜0.01）或单独阻断PD-1组（P＜0.01）,显著小于同型对照组（P＜0.001）。结论:联合阻断B7-H3和PD-1发挥了协同作用,抗肿瘤的疗效比单一阻断其中一种免疫检查点的疗效更显著。联合阻断B7-H3和PD-1可能是宫颈癌免疫治疗的新策略。