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玉米是重要的粮食兼饲料作物和工业原料,具有重要的经济地位。干旱是影响玉米生长发育和产量的最主要非生物胁迫因子之一,探究玉米干旱胁迫响应中的基因调控网络,挖掘抗旱关键基因对于培育抗旱玉米新品种具有重要意义。NF-Y是真核生物中普遍存在的一类转录因子,由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成,在植物中参与了植株生长发育及开花周期调控、光合作用、内质网胁迫响应及干旱、高温、盐等非生物胁迫响应。本实验室在前期工作中通过玉米抗旱自交系和干旱敏感自交系的转录组比较发现,ZmNF-YB16在渗透胁迫处理后的抗旱自交系中有较高丰度的表达,而干旱敏感自交系则变化不明显。将该基因转入玉米植株,发现ZmNF-YB16过表达可以显著提高玉米的抗旱性,并提高了玉米的产量。本论文在此基础上开展ZmNF-YB16转录因子在玉米抗旱机制中的作用研究。ZmNF-YB16与ZmNF-YC17、ZmNF-YA1形成异型三聚体调控下游基因的表达构建了滴度为9.5×107 cfu/mL的玉米三叶期植株cDNA酵母文库,以ZmNF-YB16为诱饵筛选互作蛋白。在筛选结果中有一个编码ZmNF-YC家族蛋白的基因 ZmNF-YC17(GRMZM2G311316/Zm00001d024230),利用 BiFc 和 Pull-down 验证了 ZmNF-YB16和ZmNF-YC17存在直接的相互作用。互作区段分析表明二者互作是依赖于ZmNF-YB16的Histone like保守结构域。采用酵母三杂交技术,确定了 ZmNF-YB16-ZmNF-YC17 异型二聚体可以与 ZmNF-YA1 或 ZmNF-YA7 形成异型三聚体,进化树分析也表明ZmNF-YA1和ZmNF-Y7的最长转录本序列之间相似性最高。亚细胞定位得出,正常条件下ZmNF-YB16和ZmNF-YC17的荧光信号主要分布在胞质中,少量存在于核中;渗透胁迫处理后,两者信号由胞质转移向核中,且存在共定位模式。ZmNF-YA1和ZmNF-YA7无论在正常还是渗透胁迫条件下,其信号存在于核中。这些结果表明ZmNF-YB16-YC17-YA1或ZmNF-YB16-YC17-YA7异型三聚体是在细胞核中形成的。利用RNA sequencing技术,对ZmNF-YA1过表达、zmnf-ya1突变体及其相应的野生型材料进行了干旱胁迫条件下的基因表达分析,发现2个与碳代谢相关的GO、5个与胁迫响应相关的GO、12个与核糖体组装相关的GO在ZmNF-YA1 OE及zmnf-ya1 mutant材料中的富集程度与其相应的对照材料之间存在明显差异。结合转录组测序数据、顺式作用元件分析、chip-qPCR和酵母单杂交验证结果,初步确定了 7个ZmNF-YB16-YC17-YA1 异型三聚体调控的靶基因,即GRMZM2G042895(ZmbH国LH1116)、AC205413.4_FG001(ZmPOD64)、GRMZM2G058310(ZmAMY)、GRMZM2G023081(ZmCNR9)、GRMZM2G102760(ZmLOX5)、GRMZM2G051135(ZmMBF1c)和GRMZM2G089106(ZmLSD1),其中ZmLOX5基因的富集程度最为明显。利用EMSA技术确定了异型三聚体对靶基因的调控是通过NF-YA亚基结合启动子区域的CCAAT顺式作用元件实现的。ZmNF-YB16复合体中存在其他结合蛋白利用ZmmNF-YB1 6-GFP融合基因转化的原生质体进行Co-IP实验筛选到3个蛋白,分别为homeodomain转录因子(GRMZM2G153263)、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(GRMZM2G180691)和60S核糖体蛋白(GRMZM5G868433)。酵母双杂交检测表明ZmNF-YB16不能与GRMZM2G153263蛋白互作,且与ZmNF-YB16的磷酸化状态无关;ZmNF-YB16的磷酸化状态变化能改变其与ZmNF-YC17的互作关系,当第4、8、17、18位氨基酸突变后不再与ZmNF-YC17形成二聚体。ZmNF-YC17与GRMZM2G153263蛋白之间存在互作,且异聚体的形成发生在核中,推测GRMZM2G153263 蛋白与 ZmNF-YB16-YC17-YA1 异聚体形成复合体。ZmNF-YC17和GRMZM2G153263的器官表达模式极其相似,在雄穗中的表达水平最高,其次是V5时期的根和叶片,两基因均受到渗透胁迫的诱导,这种相似的表达模式可能与异聚体的形成与功能有重要的关系。干旱胁迫对玉米不同器官转录组的影响玉米V9雌穗、5DAP叶片和籽粒三个器官的正常发育对于产量形成有重要的意义。V9时期的干旱胁迫通过影响雌穗顶端小穗的正常发育及小穗原基的正常分化,导致行粒数和穗行数的减少,造成了产量的大幅度下降。5DAP时期的干旱胁迫严重影响了叶片的光合作用,抑制了果穗籽粒及传递细胞的正常生长发育,影响了干物质在籽粒中的传递和积累,最终导致了产量的下降。从转录组水平探究干旱胁迫对不同器官的影响,发现3个器官中共同的差异表达基因为292个,聚类分析表明这三个器官在响应干旱胁迫时,差异表达基因的表达水平变化并未表现出明显的一致性,器官差异明显。由于在干旱胁迫中,不同器官的生长发育状态不同,遭受的胁迫程度也不同,基因表达必然表现出器官特异性。这些共同差异表达基因中存在诸多与胁迫响应相关的基因,包括热胁迫、氧化胁迫、多个与乙烯响应相关的基因和bZIP、WRKY家族转录因子等。与热胁迫响应相关的多为热激蛋白基因,与氧化胁迫相关基因中4个编码硫氧还原蛋白。基因表达分析显示,与胁迫响应相关的差异表达基因除个别外均表现出上调表达的趋势。干旱胁迫影响玉米V9雌穗的光合作用-天线蛋白,光合作用、内质网胁迫影响和激素信号响应信号通路基因的表达,光合作用信号通路差异表达基因在野生型雌穗中多呈现上调表达的趋势。内质网胁迫响应通路的差异表达基因多为热激蛋白基因,有HSP4、HSP20、HSP18、HSP70等。V9雌穗细胞分裂和分化旺盛,干旱胁迫引起的差异表达基因显著富集于多条激素信号通路中,包括ABA、生长素、细胞分裂素、乙烯和赤霉素的信号通路,提示干旱胁迫对雌穗细胞的代谢和命运产生重要影响。干旱胁迫对穗位叶的功能影响明显,在野生型中差异表达基因显著富集于光合作用、代谢过程、次级代谢过程、光合作用-天线蛋白和碳代谢过程中。光合作用通路中的差异表达基因大部分为光系统Ⅰ和光系统Ⅱ亚基蛋白基因,且胁迫后表达下调,即干旱胁迫严重抑制了植株的光合作用,减少生长发育需要的能量供给。碳代谢的差异表达基因集中在TCA循环及关联步骤中,干旱胁迫引起柠檬酸合成受抑制,ATP产生减慢,细胞能量供给和合成中间物减少,导致植株生长发育延缓。幼嫩籽粒的生长发育对干旱胁迫敏感,差异表达基因显著富集于mRNA监控、光合作用-天线蛋白、氧化磷酸化、TCA循环和2-氧代羧酸代谢中。mRNA监控通路中多个丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A亚基编码基因的表达因干旱胁迫而变化,显著影响细胞蛋白的磷酸化状态及活性,引起细胞代谢变化。籽粒中能量代谢相关基因表达水平下降会影响细胞能量供给水平,导致籽粒生长发育变差。ZmNF-YB16表达水平变化对玉米基因表达的影响ZmNF-YB16过表达株系在经历干旱胁迫处理中3个器官共同的差异表达基因为502个,显著富集胁迫响应、代谢过程中。基因表达分析发现,胁迫响应相关基因在3个器官中表现出相似的表达变化,而核小体组装和碳代谢相关的基因在雌穗和籽粒中的表达趋势基本一致,与叶片器官中的表达变化差异明显。干旱胁迫条件下,ZmNF-YB16基因过表达显著影响了 V9雌穗的核糖体组装、光合作用、氧化磷酸化、TCA循环、碳代谢和核黄素代谢信号通路基因的表达。随着ZmNF-YB16表达水平的提高,玉米中多条信号通路共同调控作用,雌穗在蛋白质合成速率上做出快速反应,同时维持了较高的能量转化效率使植株表现出优于野生型的特性。ZmNF-YB16过表达植株叶片干旱胁迫后的差异表达基因富集于碳代谢、2-氧代羧酸代谢、N-聚糖合成、糖胺聚糖降解和类黄酮合成。与野生型不同的是过表达植株的差异表达基因在光合作用通路中并未富集,提示在干旱处理条件下ZmNF-YB16基因的过表达有利于叶片光合作用的维持。叶片碳代谢相关的差异表达基因有122个,其中有38个和30个在雌穗和籽粒中也分别表现差异表达,表明碳代谢通路在干旱处理植株的叶片中变化最大,而在迅速发育且受到严格保护的器官中变化较小。干旱胁迫条件下,ZmNF-YB16表达水平的变化影响了叶片光合作用系统、内质网蛋白质的加工、谷胱甘肽代谢等通路基因的表达。ZmNF-YB16过表达维持了植株在胁迫条件的较高光合作用效率和较强抗氧化能力,稳定了蛋白质加工能力,提高了植株的抗逆性。ZmNF-YB16过表达植株幼嫩籽粒中干旱胁迫响应基因富集于代谢过程、次级代谢过程、蔗糖和淀粉代谢、氨基糖和核苷糖代谢、苯丙烷合成通路中。干旱胁迫下,ZmNF-YB16过表达影响了蔗糖和淀粉代谢、类黄酮类的代谢、谷胱甘肽代谢等通路基因的表达。差异表达基因分析发现,干旱胁迫下ZmNF-YB16过表达影响了蔗糖和淀粉代谢,有利于籽粒维持较高的蔗糖浓度而降低单糖水平。ZmNF-YB16过表达对玉米初始转录本合成的影响利用4 sU短时间标记技术,对野生型和ZmNF-YB16基因过表达株系在不同条件下的初始转录本进行研究。首先确定了 4 sU标记玉米幼苗的适宜浓度2mM,在正常或热处理条件下标记时间2 h,而渗透胁迫条件下标记时间6 h。以野生型为参照,过表达ZmNF-YB16基因株系的差异表达初始转录本因处理条件不同而有差异,正常生长、热胁迫和渗透胁迫条件下初始转录差异表达基因个数分别为3184个、3196个、2800个。三种条件下,ZmNF-YB16过表达明显影响了氧化还原、氧化胁迫响应和化学刺激胁迫响应中的相关基因的转录。三种条件下共同的差异表达初始转录本基因中,许多编码细胞色素P450、氧化酶类、过氧化物酶类蛋白。对这些基因进行注释,得出ZmNF-YB16基因通过提高抗氧化胁迫能力在玉米抗逆机制中扮演着重要角色。正常和热胁迫条件下,差异表达初始转录本富集GO有较多重叠,包括胁迫响应、程序性细胞死亡、自噬等过程,暗示ZmNF-YB16表达水平的变化影响了细胞抗逆信号转导过程。渗透胁迫条件下,ZmNF-YB16基因过表达显著影响了参与DNA复制、核小体组装、染色质聚合和解聚、染色体组装等过程的基因转录,如组蛋白编码基因。在过表达株系中包括组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4等蛋白的编码基因呈现下调表达,这些变化导致核小体组装减少,染色体活跃状态增加。差异表达的初始转录本分析结果表明,ZmNF-YB16对基因表达的影响是复杂的,多靶点的,在不同环境条件下可能通过与不同蛋白互作行使不同的调控作用。综上所述,本工作揭示了 ZmNF-YB16可以与ZmNF-YC17、ZmNF-YA1形成异型三聚体,异三聚体通过ZmNF-YA1亚基因结合于胁迫响应和生长发育相关基因启动子区域的CCAAT顺式作用元件上,调控了多个与抗逆和生长相关基因的表达,提高了植株的抗旱性。通过3个不同器官的转录组比较分析,ZmNF-YB16过表达明显影响植株的生长发育和抗旱性,具有功能的复杂性和多样性,ZmNF-YB16在不同器官中显示出不同的调节作用。