论文部分内容阅读
本文分为以下几个部分进行探讨： 第一部分 DAPK1调控β-淀粉样蛋白引起的小胶质细胞白介素-1β生成过程 目的：研究β-淀粉样蛋白（Aβ）能否引起小胶质细胞内白介素-1β生成、及激活炎性小体和DAPK1，并探讨DAPK1在调控炎性小体激活过程中的作用。 方法：选用小鼠Bv2小胶质细胞系，实验共分为A、B、C三个部分。A部分探究Aβ能否引起小胶质细胞白介素(IL)-1β生成、及激活NLRP3炎性小体和DAPK1，实验分组：①对照组(control)；②LPS组：用100 ng/ml LPS处理；③Aβ组。 B部分研究改变DAPK1表达是否影响小胶质细胞内NLRP3炎性小体激活过程，实验分为6个组：①转染对照+LPS组（Scr+LPS）：细胞转染对照shRNA，再用100 ng/ml LPS处理；②转染对照+LPS+Aβ25-35组（Scr+LPS+Aβ25-35）：细胞转染对照shRNA，用LPS处理6h后，再用25μM Aβ25-35处理。 C部分研究DAPK1活性对小胶质细胞内NLRP3炎性小体激活的影响。实验分为4个组：①LPS组：细胞用100 ng/ml LPS处理；②LPS+DAPK抑制剂组（LPS+DI）：细胞用LPS处理5h，再用20μM DAPK1 inh处理。 结果：A部分结果显示，同control组比较，（1）LPS+Aβ25-35组IL-1β产生量明显增加（Aβ25-35处理6h，P<0.05；Aβ25-35处理24h，P<0.001；Aβ25-35处理48h，P<0.001），Aβ25-35处理24h小时时IL-1β产生最多，单独用LPS或Aβ25-35处理细胞，不能引起IL-1β产生量明显增加(P>0.05)。（2）LPS+fAβ1-42与LPS+oAβ1-42组细胞，IL-1β产生量稍有增加，但不显著(P>0.05)。 B部分结果显示，（1）DAPK1-shRNA+LPS+Aβ25-35组细胞，与Scr+LPS+Aβ25-35组相比，IL-1β产生明显减少（P<0.001）、有活性的caspase-1减少（P<0.001）、p-MLC表达减少(P<0.001)。（2）cDAPK1+LPS+Aβ25-35组细胞，与DAPK1-shRNA+LPS+Aβ25-35组相比，IL-1β产显著增多（P<0.001）、caspase-1 p20表达增加（P<0.001）、p-MLC表达也增加（P<0.001）。 C部分结果显示，与LPS+Aβ25-35组细胞相比，（1）LPS+Aβ25-35+DI组IL-1β分泌显著减少（DAPK1 inh5μM，P<0.05；DAPK1 inh10μM，P<0.05；DAPK1 inh20μM， P<0.001）, DAPK1 inh为20μM时IL-1β减少最为明显；DAPK1 inh本身对细胞IL-1β产生无明显影响（P>0.05）。（2）LPS+Aβ25-35+DI（20μM）组细胞内 p-MLC和caspase-1 p20表达明显减少（P<0.01）。 结论：（1）LPS与Aβ25-35联合刺激小胶质细胞，可引起IL-1β分泌，并激活NLRP3炎性小体和DAPK1。（2）DAPK1可调控Aβ25-35引起的小胶质细胞IL-1β生成过程，其调控作用主要发生在NLRP3炎性小体组装激活阶段。（3）DAPK1的活性是其发挥调控作用必需的。 第二部分 组织蛋白酶B与DAPK1的相互作用 目的：研究组织蛋白酶B与DAPK1活化的相互作用。 方法：实验分为A、B、C三个部分。A部分研究Aβ25-35刺激能否引起细胞溶酶体破坏和cathespin B释放。实验分为3个组：①对照组（control）；②LPS组：细胞用100 ng/ml LPS处理；③LPS+Aβ25-35组：细胞用LPS处理6h，再用25μM Aβ25-35处理。Aβ25-35处理24h后，使用细胞荧光染色观察溶酶体和cathespin B。 B部分研究抑制cathepsin B是否影响Aβ25-35诱导的IL-1β生成、炎性小体和DAPK1激活。实验分为4个组：①LPS组：细胞用100 ng/ml LPS处理；②LPS+cathespin B抑制剂组（LPS+CatB inh）：细胞用LPS处理5h，再用5μM CatB inh处理；③LPS+Aβ25-35组：细胞用LPS处理6h后，再用25μM Aβ25-35处理。 C部分研究抑制DAPK1活性是否影响cathespin B向胞浆释放过程。实验分为4个组：①LPS组：细胞用100 ng/ml LPS处理；②LPS+DAPK抑制剂组（LPS+DI）：细胞用LPS处理5h，再用20μM DAPK1 inh处理；③LPS+Aβ25-35组：细胞用LPS处理6h后，再用25μM Aβ25-35处理。 结果：A部分结果显示，LPS与Aβ25-35联合刺激引起小胶质细胞溶酶体破坏，其内容物cathepsin B释放入胞浆。 B部分结果显示，与LPS+Aβ25-35组细胞相比，（1）LPS+Aβ25-35+CatB inh组IL-1β分泌量显著减少（CatB inh2.5μM，P<0.001；CatB inh5μM，P<0.001），Cat B inh为5μM时减少最为明显。（2）LPS+Aβ25-35+CatB inh（5μM）组细胞内caspase-1 p20和p-MLC表达明显减少（P<0.05），细胞过表达DAPK1可恢复IL-1β分泌。 C部分结果显示，与LPS+Aβ25-35组细胞相比，LPS+Aβ25-35+DI组细胞内有活性的cathepsin B表达水平无变化(P>0.05),溶酶体破坏和cathespin B释放未受影响。 结论：（1）Aβ25-35刺激可引起小胶质细胞溶酶体破坏、cathepsin B释放入胞浆，此过程是NLRP3炎性小体激活必需。（2）Cathepsin B是DAPK1的上游分子, DAPK1对cathepsin B释放过程无影响。 第三部分 DAPK1参与调控小鼠海马区NLRP3炎性小体激活过程 目的：研究DAPK1在Aβ25-35引起的小鼠海马区IL-1β生成和记忆能力受损中的作用。 方法：实验分为A、B、C三个部分。A部分研究Aβ25-35可否激活小鼠海马区小胶质细胞、NLRP3炎性小体和DAPK1。SPF级健康雄性C57BL/6小鼠30只，8-10周，体重23-25g,随机分成两组：①假手术组(sham)：侧脑室注射PBS3μl；②Aβ25-35组：侧脑室注射Aβ25-35（3 nmol）3μl。48h后处死小鼠、收集脑组织。应用免疫荧光染色法，观察海马区小胶质细胞激活标记物Iba1、NLRP3和DAPK1表达；western blotting检测NLRP3炎性小体各成分、DAPK1和p-MLC表达水平。 B部分研究抑制DAPK1活性能否减少小鼠海马区IL-1β产生和NLRP3炎性小体激活。选用SPF级雄性C57BL/6小鼠50只，8-10周，体重23-25 g，随机分成5组：①sham+vehicle组：侧脑室注射10％DMSO溶液2μl,1h后注射PBS3μl;②sham+DAPK1抑制剂组（sham+DI组）：侧脑室注射5 nmol DAPK1 inh（2μl）,1h后注射 PBS;③Aβ25-35+vehicle组:侧脑室注射 DMSO溶液，1h后注射 Aβ25-35（3nmol）3μl。 C部分研究抑制DAPK1活性是否能改善Aβ25-35引起的小鼠记忆能力下降。SPF级健康雄性C57BL/6小鼠44只，8-10周，体重23-25g，随机分成4组：①sham+vehicle组：10%DMSO腹腔注射8天后，侧脑室注射PBS3μl；②sham+DI组：DAPK1 inh(1 mg/kg/day)腹腔注射8天后，侧脑室注射PBS。 结果：A部分结果显示，与sham组比较，（1）侧脑室注射Aβ25-3548h后，小鼠海马区Iba1和NLRP3免疫荧光强度增加。（2）Aβ25-35组小鼠海马内NLRP3、caspase-1 p20、IL-1β前体(pro-IL-1β)、p-MLC表达明显增加(P<0.05)。 B部分结果表明，与Aβ25-35+vehicle组比较， Aβ25-35+DI组小鼠海马内（1）IL-1β含量减少，DAPK1 inh剂量为5 nmol时，差异具有统计学意义(P<0.01);（2）p-MLC和caspase-1 p20表达明显减少(P<0.05)。 C部分结果表明，与sham+vehicle组小鼠比较，Aβ25-35+vehicle组新奇物体识别指数明显降低(P<0.05)，背景恐惧和条件恐惧下freezing时间均显著减少(P<0.05)；给予DAPK1 inh可明显增加Aβ25-35+vehicle组小鼠的识别指数(P<0.01)、背景恐惧和条件恐惧下的freezing时间(P<0.001)。另外，OFT显示，四组小鼠总运动距离无统计学差异。 结论：Aβ25-35注射激活小鼠海马内NLRP3炎性小体和DAPK1，并导致认知功能障碍；抑制DAPK1活性可减少Aβ25-35所致的NLRP3炎性小体活化和IL-1β生成，并改善小鼠的认知功能。