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贯叶金丝桃素(hyperforin,HF)是贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)提取物中抗抑郁作用的主要活性成分之一,具有抗抑郁、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗老年痴呆和促进学习记忆等多方面的药理活性。HF遇光、氧、热极易发生化学氧化降解。已有研究表明,HF乙酸酯等衍生物化学性质稳定并保留HF原有的药理活性。为促进我国贯叶连翘资源的深入开发与新药研制,本论文围绕着HF乙酸酯(Ac-HF)、HF八氢还原乙酸酯(8H-Ac—HF)及HF—N,N二环己胺盐(DCHA-HF)的制备及其抗肿瘤活性、作用机理进行了研究。
本文主要研究内容与成果总结如下:
1.以富含HF的提取物为原料,通过乙酰化反应、氢化还原反应及成盐反应得到HF乙酸酯、HF八氢还原乙酸酯及HF-N,N二环己胺盐的稳定衍生物。
2.采用制备高效液相色谱法分离制备了Ac-HF,其纯度>99％。
3.采用高速逆流色谱法分离制备Ac-HF和加贯叶金丝桃素乙酯(Ac-AHF)。研究比较了多种不同溶剂系统,考察了HSCCC的流速、转速和进样量对分离效果的影响。采用优化所得HSCCC工艺条件进行Ac-HF和Ac-AHF制备分离,结果显示,经1次HSCCC分离,在6.5 h内可同时分离纯化得到132.5 mg Ac-HF(纯度>98％)和7.4 mg Ac-AHF(纯度>95％)。该方法操作简捷,快速高效,费用低廉,重现性好,是分离制备高纯度Ac-HF和Ac-AHF的有效方法。本研究可为大量制备这两个化合物并进行进一步的药理活性及其作用机制研究提供重要的物质基础。
4.对Ac-HF、8H—Ac-HF及DCHA-HF进行了抗肿瘤活性筛选。采用MTT法、以阿霉素为阳性对照,考察了这3种衍生物对人宫颈癌细胞株Hela、人恶性黑色素瘤细胞株A375、人肝癌细胞株HepG2、乳腺癌细胞株MCF7、肺腺癌细胞株A549、人慢性髓性白血病细胞株K562及人白血病阿霉素耐药细胞株K562/ADR的体外增殖抑制作用。结果表明,Ac-HF、DCHA-HF对这7种肿瘤细胞株均有抑制作用,IC50值为3.24～64.14μM,而8H-Ac-HF的IC50值>100μM,不显示抗肿瘤活性。Ac—HF、DCHA-HF对Hela、A375、A549、K562及K562/ADR细胞株表现出呈剂量依赖性的增殖抑制作用；而Ac-HF对于HepG2、DCHA-HF对于HepG2和MCF7表现出先上升后下降再上升的增殖抑制作用。
5.用DAPI/TUNEL法和流式细胞术考察了DCHA-HF对K562和HepG2细胞株的凋亡作用。DAPI/TUNEL法检测结果表明:经10μM的DCHA-HF孵育48 h后,K562和HepG2细胞出现明显的凋亡现象,在激光扫描共聚焦显微镜下可看到许多散在分布的凋亡细胞,发出强烈的绿色或黄色荧光。
流式细胞术分析显示,经DCHA—HF作用48 h后,K562、HepG2肿瘤细胞出现晚期凋亡或者死亡现象；并且这种凋亡或死亡现象表现出明显的剂量依赖关系。DCHA-HF主要通过将K562细胞阻滞在细胞周期中的G1期来诱导细胞凋亡；而对于HepG2,则是将其阻滞在细胞周期中的G2/M期来诱导细胞凋亡的。
10μM的DCHA-HF引起了K562细胞线粒体跨膜电位的显著降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)；并且这种线粒体跨膜电位的降低作用呈时间依赖关系。