论文部分内容阅读
虽然早在1993年就有报道矮小型鸡是由生长激素受体基因(growth hormone receptor,GHR)的片段缺失或碱基突变引起的,但是还有一些矮小鸡种,如中国贵州黄鸡、信义矮脚黄鸡中并未发现片段缺失和碱基突变,因此矮小性状的形成可能还有其它的机制存在.要全面的搞清楚鸡矮小性状形成的机制,需要一些新的研究途径和方法。
本研究采用了RNAi技术研究鸡的矮小性状.通过以不含dw基因的粤黄鸡GHR基因为干涉靶标,构建了针对鸡GHR基因的4个shRNA(Short Hairpin RNA)表达质粒作为干涉剂,对鸡的原代肝细胞中的靶基因GHR进行沉默,筛选出能用于后期活体实验的质粒;还以不含dw粤黄鸡GHR基因为干涉靶标,体外直接合成4对siRNA(Small Interfering RNA)小片段,进行化学修饰后与脂质体转染剂共转染鸡的肝细胞,同样将筛选出的化学修饰的siRNA用于活体实验:用筛选出的化学修饰的siRNA和shRNA表达质粒进行鸡体内干涉实验,通过性状测量判断干涉的效果;最后将实验鸡处死后,采集各种组织,对GHR基因及其上下游相关基因的表达进行研究,得出它们之间的互作关系,从而进一步阐明矮小型鸡产生的分子机制.
结果显示:干涉GHR基因后,正常母鸡胸深有增长变慢的趋势,正常公鸡胸深有增长加快的趋势.且矮脚母鸡的胸深小于正常鸡,而矮脚公鸡胸深大于正常鸡.给鸡体内直接注射化学修饰的小干涉片段,和发夹结构表达质粒对鸡的体重、胫长和胫围影响效果一样,都是起到抑制生长的作用,对毛色都有加深作用.干涉3-8周后经RT-PCR实验后发现,干涉组相对于空白对照组进行比较,shRNA表达质粒大组中,干涉组母鸡肝脏中GHR基因的mRNA表达量下调约5％,肝脏中IGF-1下调约87.1％,腹脂中的THRSP(Thyroid Hormone Responsive Spot 14 Protein)相对下调约60％,心肌中H-FABP(Heart Fatty Acid-Binding Proteins)基因的mRNA表达量上调约31％.干涉组公鸡肝脏中GHR基因的mRNA表达量下调约71％,肝脏中IGF-1下调约90％,THRSP相对下调约99.8％,心肌中H-FABP基因的mRNA表达量下调约10％.
干涉3-6周后,经RT-PCR检测,siRNA小片段干涉组母鸡肝脏中的GHR基因mRNA表达量相对下调约86.7％,腿肌中的GHR基因下调约63.7％;肝脏中IGF-1下调约98.9％,而腿肌中IGF-1下调约96.8％;母鸡干涉组腹脂中的THRSP相对于阴性对照是下调了93.9％,心肌中H-FABP基因的mRNA表达量相对下调了90.7％.
公鸡肝脏中GHR基因的mRNA表达量下调约55％,腿肌中GHR下调约39％;肝脏中IGF-1上调约0.08％,腿肌中IGF-1下调约99.7％.腹脂中的THRSP相对下调了58.5％,心肌中H-FABP基因的mRNA表达量下调了92.4％. shRNA干涉组与siRNA干涉组相比,不同在于shRNA干涉组第八周母鸡心肌中H-FABP基因的mRNA表达量上调约31％,而siRNA组母鸡是在第六周时H-FABP基因的mRNA表达量下调了93.9％,siRNA干涉组公鸡肝脏中IGF-1上调约0.08％,这可能与干涉时间的长短和测量的时间有关系.
两组实验结果均表明GHR基因的mRNA在体内发生了降解,引起相关基因的表达发生了变化,GHR基因mRNA表达量下调导致IGF-1基因mRNA表达量下调,影响了体重和胫长及其它表型性状的变化.但公鸡的GHR和IGF-1的mRNA的表达量变化不同于母鸡,甚至公鸡siRNA组是肝脏中IGF-1表达量相对微小上调.但腿肌中的IGF-1表达量却是下调了99.7％,提示GHR和IGF-1对公鸡的肌肉生长起着重要的作用.而IGF-1的表达下降,抑制了黑皮质激素受体l的表达,导致了鸡羽毛颜色的改变.
针对前人研究还发现GHR基因还同脂肪的沉积有关,本研究着重研究了腹脂中的THRSP和心肌中的H-FABP基因.mRNA的表达量变化.结果表明,IGF-1的mRNA表达量下降,连锁抑制了THRSP和H-FABP基因mRNA的表达,导致了干涉组鸡的腹脂和肌间脂肪沉积能力下降,甚至可以说GHR基因的mRNA表达量直接影响脂肪的沉积能力.
RNAi机制并非GHR基因片段缺失也非碱基突变.且干涉实验导致公母间基因表达差异较大,说明矮脚性状的形成可能还有其它的机制存在.