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NF-κB是一类重要的转录因子蛋白,存在于大多数哺乳动物细胞中,包括五个成员:p50/p105、p52/p100、p65(RelA)、c-Rel和RelB。NF-κB信号通路包括两种类型,分别是经典通路和非经典通路。经典的NF-κB通路由肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)以及活性氧(ROS)等各种细胞促炎因子刺激而激活。静息条件下,NF-κB(p65/p50)与抑制蛋白IκBa分子结合,并被其锚定在细胞浆中,以此来维持NF-κB的抑制状态。当细胞受到TNF等因子刺激时,其因子的受体通过招募一系列蛋白,激活IκBa的激酶(40)(42)(42)复合物((40)(42)(42)a(14)(40)(42)(42)b(14)(40)(42)(42)g),激活后的IKK促进IκBa蛋白发生磷酸化,磷酸化的IκBa随机发生泛素化降解,促进NF-κB(p65/p50)入核并启动下游靶基因的转录,最终激活下游的信号通路。而非经典NF-κB通路的激活因子主要包括CD40L、BAFF、LTβR等,在这些因子的刺激下,IKKa激酶和NIK激酶将NF-κB前体分子p100磷酸化,磷酸化的p100被加工为成熟的NF-κB分子p52,随后p52与RelB形成异源二聚体,入核并启动下游靶基因的转录。由于这个途径不需要(40)(42)(42)b(14)(40)(42)(42)g这两个分子的参加,因此被称为NF-κB非经典通路。NF-κB信号通路的激活可诱导多个下游靶基因的转录,这些下游靶基因主要编码:细胞因子、黏附分子、免疫调节分子、生长因子等蛋白。通过调控这些基因的表达,NF-κB参与了免疫应答,炎症反应、细胞凋亡及肿瘤发生等生物学过程。尤其是NF-κB通路与肿瘤发生发展密切相关。文献报道,NF-κB通路的一些关键蛋白在多种炎性肿瘤中,存在激活突变或高表达,促进了NF-κB信号通路的激活,从而通过影响细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤转移及血管生成等过程,在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。目前关于NF-κB信号通路的调控方式有很多,主要包括泛素化、磷酸化、甲基化、乙酰化等翻译后修饰类型。然而,对于NF-κB信号通路这样一条复杂且重要的信号通路,关于其调控机制依然有很大的研究空间。实验室前期通过siRNA文库筛选参与调控NF-κB信号通路的蛋白,筛选得到二十多个影响NF-κB信号通路的候选调控分子。在这些候选基因中,我们选择WDSUB1蛋白进行深入研究,并进一步验证了其对NF-κB信号通路的调控功能。WDSUB1蛋白有泛素连接酶活性,属于U-box E3酶家族,包含SAM、U-box和WD40三种结构域,目前关于WDSUB1的生物学功能知之甚少。研究发现,敲低WDSUB1可以明显抑制经典的NF-κB信号通路的激活。进一步研究发现,干涉WDSUB1并不影响IκBa蛋白的泛素化降解过程,而是明显抑制了p65分子的入核和下游靶基因IκBa的蛋白合成。这些结果表明,WDSUB1参与了经典的NF-κB信号通路的激活。综上所述,我们发现了一个经典NF-κB信号通路的正调控分子——WDSUB1,然而关于其具体的调控机制还需要深入研究。初级纤毛(primary cilia)作为细胞的“天线”,存在于大多数哺乳动物细胞表面,主要负责感知、整合并传递各种信号刺激。初级纤毛参与调控的信号通路主要包括Hedgehog,Wnt和PDGF等,这些信号通路的激活对于维持胚胎的正常发育和功能至关重要。一旦纤毛的结构或功能发生异常,就会导致多种发育缺陷疾病,如SLS综合征(Senior-Loken syndrome),肾消耗病,Joubert综合征,Bardet-Biedl综合征以及Meckel综合征等,这类疾病统称为纤毛缺陷性疾病。初级纤毛的发生和细胞周期进程密切相关。当细胞进入细胞周期后,中心体在S期进行复制,并在有丝分裂期发射微管形成纺锤体,确保姐妹染色体的精确分离;当细胞进入静息状态后,母中心粒分化成基体,并由基体向外延伸微管形成初级纤毛。初级纤毛的发生是一个精细有序的组装过程,该过程主要包括三个进化上十分保守的步骤。首先,在纤毛发生的起始阶段,中心体分化成基体进而锚定到细胞膜上。接着,母中心粒向外延伸形成过渡区。最后,微管在IFT运输蛋白的帮助下不断向外延伸,形成初级纤毛。随着纤毛缺陷疾病相关基因的陆续发现,关于初级纤毛的功能和调控机制也逐渐成为当前的研究热点。尽管科学家们已发现多个负责正向调控纤毛发生的蛋白质,但目前关于纤毛发生的负调控子主要有两个,分别是CP110和其伴侣分子Cep97。研究表明,在纤毛发生过程CP110和Cep97必须要从母中心粒上消失,但关于二者定位消失的机制知之甚少。SNAP23是SNARE蛋白家族中的一员,在静息条件下主要定位在细胞膜上,也有研究发现SNAP23在细胞中参与GLUT4向质膜转运的过程。目前已报道的SNAP23的功能主要集中在囊泡融合介导的细胞通讯等过程,而关于SNAP23蛋白是否参与调控初级纤毛的发生还尚未有报道。而我们的研究发现,在RPE-1细胞中敲低SNAP23可以显著抑制血清饥饿条件下初级纤毛的发生。为进一步探索SNAP23调控纤毛发生的分子机制,在敲低SNAP23的细胞中,检测了一系列已知调控纤毛发生关键蛋白的中心体定位变化。在这些检测的蛋白质中,发现敲低SNAP23蛋白特异地影响了纤毛发生的两个关键开关分子CP110和Cep97的中心体定位。这些结果表明在纤毛发生过程中,SNAP23通过调控CP110和Cep97蛋白从母中心粒的消失过程从而参与纤毛的发生。接下来,将进一步揭示SNAP23调控CP110和Cep97从母中心粒消失的分子机制。综上所述,本项研究发现了一个调控初级纤毛发生的关键蛋白SNAP23,并通过初步探索发现SNAP23通过调控CP110和Cep97的定位变化进而调控纤毛的发生。我们的研究不仅发现了一个新的纤毛调控子,拓展了囊泡运输和纤毛发生之间的功能交叉,并且有助于进一步完善初级纤毛发生的分子调控网络。