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鼻咽癌是耳鼻喉喉头颈外科常见恶性肿瘤,好发于我国南方及东南亚地区。病因学研究表明,鼻咽癌的发病与EB病毒感染、遗传易感性、饮食习惯及某些环境理化因素有关,其发生也是一个多基因参与、多步骤的复杂过程,其中EB病毒扮演重要角色。在EB病毒编码的众多蛋白当中,LMP2A参与EB病毒在上皮细胞中的长期潜伏,并且在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用。本课题拟构建人LMP2A基因RNAi的慢病毒,感染人鼻咽癌C666-1细胞,观察其对细胞生物学行为和放疗敏感性的影响,为鼻咽癌提供新的治疗策略。第一部分LMP2A-RNAI慢病毒的构建及鉴定目的：本研究拟构建针对人LMP2A基因RNAi的慢病毒,诱导人鼻咽癌C666-1细胞中LMP2A基因沉默。方法：分析LMP2A mRNA序列特征,根据shRNA设计原则,设计并合成3条针对LMP2A基因的shRNA靶DNA序列和1条阴性对照序列。寡DNA片段退火成含有粘性末端的DNA双链后,T4连接酶将其与限制性核酸内切酶酶切的线性化pGCSIL-GFP载体连接,然后转化感受态细胞进行重组,运用PCR技术筛选阳性克隆并测序,得到重组质粒,转染人鼻咽癌C666-1细胞,利用实时定量PCR技术检测LMP2A基因mRNA表达水平,筛选出抑制效果最佳的pGCSIL-LMP2A-shRNA质粒。采用脂质体将pGCSIL-LMP2A-shRNA质粒和辅助包装质粒共转染到293T细胞中包装形成慢病毒,采用逐孔稀释滴度测定法检测慢病毒滴度。pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染C666-1细胞后,运用实时定量PCR技术检测LMP2A基因mRNA表达水平,运用蛋白免疫印迹技术检测LMP2A蛋白表达水平。结果：酶切后获得7.5 kb的pGCSIL-GFP片段；寡DNA片段成功连接到pGCSIL-GFP载体；pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒的滴度约为3×108TU/mL,能够高效感染C666-1细胞,并显著抑制内源性LMP2A基因mRNA和蛋白的表达。结论：成功构建针对LMP2A基因靶序列的pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒,并且能够有效沉默鼻咽癌C666-1细胞LMP2A基因。第二部分 慢病毒介导LMP2A-R NAi对鼻咽癌细胞生物学行为的影响目的：探讨慢病毒介导LMP2A-RNAi对人鼻咽癌C666-1细胞生物学行为的影响。方法：将pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染人鼻咽癌C666-1细胞设为实验组(KD组),同时设阴性病毒感染对照组(NC组)和未感染对照组(CON组)；平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,Annexin V-APC单染法观察细胞凋亡改变；SP流式细胞检测分析SP细胞比例变化；Real-time PCR和Western blot方法检测Notchl基因mRNA和蛋白的表达水平。结果：pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染鼻咽癌C666-1细胞后,细胞克隆形成能力显著下降。感染72h后,pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染组吸光度(0.238±0.002)较两对照组下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染组细胞GO/G1期、S期、G2/M期所占比例分别为52.57±1.09%、32.58±1.08%、14.85±0.97%,S期细胞较两对照组明显减少。细胞凋亡结果显示,pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染组细胞凋亡率为]4.32±0.38%,与两对照组相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染C666-1后,SP细胞比例下降,Notchl基因mRNA和蛋白的表达下调。结论：慢病毒介导的LMP2A-RNAi可显著抑制人鼻咽癌C666-1细胞的克隆形成和细胞增殖,并且诱导细胞凋亡,可能通过下调Notchl,降低SP细胞比例的机制而发挥作用。第三部分慢病毒介导LMP2A-RNAi对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响目的：探讨慢病毒介导LMP2A-RNAi对人鼻咽癌C666-1细胞放疗敏感性的影响。方法：将pGCSIL-LMP2A-shRNA’慢病毒感染人鼻咽癌C666-1细胞后进行放疗干预,设为实验组(KD组),同时设阴性病毒感染对照组(NC组)和未感染对照组(CON组)；平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,Annexin V-APC单染法观察细胞凋亡的改变。结果：pGCSIL-LMP2A-shRNA’慢病毒感染细胞组细胞克隆形成能力显著下降。感染72h后,pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒感染组吸光度(0.135±0.004)较两对照组下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。pGCSIL-LMP2A-shRNA’慢病毒感染组细胞G0/G1期、S期、G2/M期所占比例分别为55.37±1.08%、31.48±1.07%、13.15±12.94%,S期细胞较两对照组明显减少。细胞凋亡结果显示,pGCSIL-LMP2A-shRNA’慢病毒感染组细胞凋亡率为21.12±0.45%,与两对照组相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：慢病毒介导的LMP2A-RNAi可显著增强人鼻咽癌C666-1细胞放疗敏感性。本研究针对LMP2A靶基因,以慢病毒作为RNAi表达载体,成功构建了靶向LMP2A基因的pGCSIL-LMP2A-shRNA’慢病毒；pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒对人鼻咽癌C666-1细胞LMP2A基因mRNA和蛋白表达有明显抑制作用,并通过下调Notchl,降低SP细胞比例,进一步抑制C666-1细胞的克隆形成和细胞增殖,以及诱导细胞凋亡；pGCSIL-LMP2A-shRNA慢病毒能够显著增强C666-1细胞放疗敏感性,为鼻咽癌治疗提供新的思路和方法。